Diagnosticul de laborator al endotoxemiei la cabaline

Atunci cand bacteriile Gram-negative se multiplica sau apare liza lor, ca urmare a mortii celulare bacteriene, elibereaza o lipopolizaharida (LPS) structurala de la nivelul peretelui celular extern care poate fi eliberata fie libera, fie legata de alte proteine bacteriene de suprafata. LPS libera este de douazeci de ori mai activa din punct de vedere biologic decat LPS legata de peretele celular si, desi exista si alte produse bacteriene capabile de suscitarea unui raspuns imun, este o convingere generala ca LPS este principala raspunzatoare pentru manifestarile starii de endotoxemie.

La caii sanatosi, exista o rezidenta normala de bacterii gram negative la nivelul intestinului gros, existand astfel si o cantitate mare de LPS. Absorbtia acesteia este insa oprita de catre un mecanism de aparare ce cuprinde jonctiunile stranse intre celulele epiteliale, secretia acestor celule si alte bacterii rezidente. Tot la acesti cai pot aparea mici cantitati de LPS care penetreaza bariera mai sus mentionata si ajung in circulatia portala, dar toxina este neutralizata partial de catre anticorpii anti endotoxina circulanti, iar restul legandu-se de proteine specifice si fiind transportat la nivelul ficatului unde va fi fagocitat de catre sistemul mononuclear fagocitar al acestui organ. 

Endotoxemia la caii adulti se regaseste in patologia clinica de obicei ca si rezultat al bolilor gastro-intestinale, cu colica severa fiind principala cauza de deces a cailor adulti, iar septicemia la nou-nascuti. Desi endotoxemia se asociaza de obicei cu boala gastrointestinala acuta, eliberarea de LPS in timpul multiplicarii bacteriene face ca fiecare cal ce sufera de sepsis cu Gram negativi sa se afle in pericol de a deveni endotoxemic. Deoarece bacteriile Gram negative sunt principalele patogene izolate de la manjii septicemici, mai mult de jumatate din manjii septicemici sunt si endotoxemici. Gravitatea leziunii intestinale se afla in corelatie directa cu gradul de toxemie, in timp ce prognosticul este determinat intotdeauna de catre sechelele post endotoxemie

Totusi, endotoxemia mai poate avea ca si cauze sepsis-ul (de diverse etiologii), pleurita, metrita, pneumonia, sau chiar laminita cauzata de un exces de carbohidrati. Exista numerosi mediatori inflamatori si vasoactivi a caror productie este indusa de catre fenomenul de endotoxemie, acestia determinand la randul lor un numar variat de manifestari clinice. Efectele endotoxemiei deriva practic din raspunsul organismului gazda la mediatorii produsi. in mod strict, termenul de endotoxemie se refera la prezenta endotoxinelor circulante in curentul sanguin, dar termenul se foloseste si in cazul aparitiei sindromului clinic atunci cand doar se presupune ca endotoxina este prezenta.

LPS poate ajunge la nivel circulator prin mai multe mecanisme, cel mai frecvent ca urmare a bolilor intestinale care compromit fluxul sanguin catre intestin, producand astfel o supraincarcare a circulatiei portale cu endotoxine si o incapacitare a sistemului de clearance hepatic (colitele grave) dar si transportul transmural al endotoxinei prin alterarea functiei mucoasei intestinale; endotoxina poate ajunge la nivel circulator si prin alte metode, originand din alte surse decat tractusul intestinal precum cavitatea peritoneala, pleurala, sau uter si intrand direct in sistemul circulator, fara sa mai treaca prin circulatia portala.

Nu este insa de neglijat faptul ca tractusul intestinal este un organ de soc important, care reprezinta in acelasi timp si cel mai mare organ cu rol imunologic, prin intermediul mucoasei intestinale, limfonodurilor mezenterice si a ficatului.

Astfel, orice trauma, boala intraabdominala acuta, ventilatia mecanica, terapie sau lipsa unei hraniri enterale poate duce cu usurinta la aparitia ileusului mecanic sau paralitic sau chiar la compromiterea totala a intestinului. La randul sau, un intestin paralizat poate induce sau agrava sepsis-ul sau socul septic, nu in ultimul rand prin endotoxinele in cantitati masive eliberate in cazurile mai sus mentionate prin translocare microbiana datorata barierei intestinale alterate.

Pentru diagnosticarea in clinica a endotoxemiei, este nevoie nu doar de o examinare amanuntita, dar si de examene de laborator: o hematologie completa si, dupa posibilitati, de o analiza a gazelor sanguine, aspecte pe care le-am descris pe larg in cadrul unui articol anterior cu focus pe sindromul raspunsului inflamator sistemic prin prisma endotoxemiei, astfel ca nu am sa mai revin asupra diagnosticului clinic si paraclinic de rutina.

Un diagnostic definitiv in endotoxemie se poate pune prin cuantificarea endotoxinei in plasma cu ajutorul testului LAL (Limulus amoebocyte lysate assay), Golden Standardul din prezent. LAL este un test al carui principiu a fost descoperit inca din 1956, cand s-a descoperit ca endotoxina unor bacterii din genul Vibrio, care erau fatale pentru crabul Limulus polyphemus, produce o coagulare intravasculara dramatica, care poate fi repetata si in vitro. intre timp, s-a mai dezvoltat un test analag din amoebocitele crabului Tachypleus tridentatus. Acest test se bazeaza pe abilitatea endotoxinei de a induce coagularea hemolimfei crabului. Desi pe moment acest test este Golden Standardul actual, utilizat in special pentru determinarea contaminarii endotoxiemice a medicamentelor si lichidelor, dar are o utilitate redusa in probele biologice, din cauza inhibitorilor reactiei de coagulare circulanti.

Mai mult, si alte produse microbiene, in special de la fungi pot activa reactia crabului, asa incat acest test nu are o spe ci ficitate de 100% pentru toxina. Pentru ca testul LAL are limitele sale in cuantificarea endotoxinelor, permitand 60% dintre toxine sa ramana neidentificate, exista si teste care cuantifica efectele biologice ale endotoxinelor prin masurarea diverselor molecule- TNF, factorul Hagemann, IL1, gama interferon si alte citokine. in medicina umana exista si un scor de cuantificare al sepsis-ului bazat pe aceste date.

La cal, datorita dificultatii integrarii testelor moleculare in practica, nu exista foarte multe date legate de acest subiect. Pentru diagnosticul endotoxemiei, se mai poate utiliza chemiluminescenta. Acest test se bazeaza pe detectarea unei activitati respiratorii explozive ale neutrofilelor. Activitatea aceasta se masoara prin prisma luminii eliberate de catre luminolul oxidat intr-un chemoluminiscentometru. CEAA (chemiluminiscent endotoxin activity assay) are o sensibilitate de 98% si o specificitate de 100%, comparativ cu testul LAL, care are o specificitate de 63% si o specificitate de 38%. Mai exact, chemiluminescenta este un test rapid (dureaza in jur de 30 de minute), ce utilizeaza sange integral si se foloseste de producerea oxidanta indusa de receptorii CR1 si CR3 a leucocitelor PMN ca platforma de detectare. Primingul diferential al neutrofilelor in sangele integral de catre complexele LPS-anticorpi duce la marea specificitate a acestui test. Oxidantul eliberat ca raspuns la zimozanul opsonizat de catre complement duce la oxidarea luminolului si la o emisie de lumina ca raspuns la aceasta.

Aceasta este dependenta de proteinele complementare din plasma, care sunt labile la caldura. Testul se compune dintro componenta de control, care masoara productia de oxidant neutrofil de baza, din sangele integral. Componenta de test propriu-zisa contine anticorpi monoclonali IgM murini impotriva epitopului lipidului A al LPS si masoara raspunsul chemiluminescent crescut al neutrofilelor in prezenta complexelor anticorp- LPS. Sensibilitatea maxima a acestui test este dependenta de echivalenta optima antigen-anticorp si de durata de pre incubare a probei de sange integral. Cuantificarea LPS este posibila prin includerea unei probe de control pozitive, ce contine o doza de LPS reactiva.

Testul nu este sensibil la variatiile din concentratia neutrofilelor pacientului pe o gama minima de 0.5 la 20×109 celule/l, dar este foarte reactiv cu LPS a mai multor linii de bacterii Gram negative, dar nu si cu produsii din peretele celular al bacteriilor Gram pozitive sau Candida si Aspergillus. intru ajutorul testelor de laborator mai sare si masurarea inflamatiei prin intermediul masurarii TNFα, din plasma heparinizata, cu ajutorul unui test de supravietuire celulara (cell survival bioassay- CSBA), pe o linie celulara murina.

Se poate observa astfel ca diagnosticul de laborator al endotoxemiei prezinta mai multe fatete fata de ceea ce ne imaginam de obicei, certitudinea diagnosticului neputand fi obtinuta decat prin intermediul unor teste costisitoare, dar utile.