Autentificare
updated 2:54 PM UTC, Oct 21, 2019

Metode de analiza micotoxicologica a unor matrice biologice

Evaluarea starii de sanatate a animalelor de companie se bazeaza in mare masura, cu precadere in etapa initiala de investigatii, pe analizarea valorilor parametrilor biochimici sangvini si ai urinei. Aceasta conduita este cu atat mai mult justificata in situatia in care semnele clinice nu sunt patognomonice unei boli sau sunt insuficiente pentru a pune un diagnostic cert.

Prin implementarea si validarea metodelor de analiza a ochratoxinei A din matrice biologice precum serul si urina s-a urmarit aprofundarea cunostintelor in sanogeneza, din perspectiva alimentatiei.

Micotoxinele – cat de mult afecteaza sanatatea animalelor de companie? Micotoxinele sunt metaboliti secundari ai fungilor micotoxigeni care afecteaza atat sanatatea umana cat si pe cea animala, producerea acestora in plante fiind extrem de imprevizibila si dependenta de o varietate de factori atat in stadiul de cultura cat si in perioada de transport, depozitare si prelucrare a materiilor prime.

Datorita structurii chimice diverse si conditiilor variate in care fungii le produc, aceste toxine sunt capabile sa provoace o mare varietate de simptome acute, in egala masura, la animale si om. in mediul natural acestea se gasesc ca si contaminanti intr-o gama foarte variata de furaje, alimente si subproduse ale acestora.

Conditii climatice – temperatura, umiditate, precipitatii, sau de microclimat, actiuni de mecanizare, fertilizare, chimizare a culturilor sunt tot atatia factori de stres pentru plante si favorizanti pentru producerea fungilor si elaborarea micotoxinelor de catre acestia. Trebuie remarcat ca se pot intalni situatii in care in furajele sau alimentele analizate se gasesc fie doar fungii, fungii si micotoxina sau micotoxinele produse de catre acestia, sau se gasesc doar micotoxinele. Ochratoxina A (OTA) este una dintre micotoxinele cu toxicitate foarte ridicata, produsa de fungi din genurile Aspergillus (A. ochraceus) si Penicillium (P. verrucosum).

 

Micotoxina afecteaza in egala masura sanatatea omului (fiind cunoscuta implicarea acesteia in nefropatia endemica balcanica si nefrita interstitiala cronica) si a animalelor, prin efectele nefrotoxice. Ochratoxina A este absorbita pasiv, in forma neionizata, la nivelul tubului digestiv, indeosebi la nivelul intestinului subtire, la un pH de 7,04. Dupa patrunderea OTA in organism, micotoxina se leaga de albumine la nivelul plasmei si incepe sa se metabolizeze relativ rapid, in functie de specia de animale.

Dintre organe, OTA are cea mai mare afinitate pentru ficat si rinichi. OTA are efectul inhibitor cel mai puternic asupra cresterii animalelor, determinand acumularea excesiva a glicogenului in ficatul animalelor bolnave Timpul de injumatatire al OTA in studiile efectuate pe maimuta a fost de 840 de ore, cateva zile in cazul porcilor si 3 ore la pui (Curtui, 1998). Cea mai importanta transformare are loc la nivel hepatic, unde OTA este metabolizata prin hidroxilare in 4-hidroxiochratoxina A, metabolit eliminat pe cale renala (Krogh, 1992).

La nivelul tubului digestiv, unde ulterior se si absoarbe, se formeaza un alt metabolit important, OT-α, care se elimina in final pe cale digestiva si renala. Alti metaboliti formati in organism urmeaza un circuit entero-hepatic dupa care se elimina de asemenea prin fecale sau urina. Literatura de specialitate, desi mai saraca in referinte in acest subiect pentru animalele de companie comparativ cu cele de ferma, prezinta efectele clinice ale ochratoxicozei la caini ca fiind: reducerea apetitului, voma, tenesme, hipertermie, tonsilita, melena, polidipsie, poliurie, deshidratare, paralizie si in final moartea animalului in aproximativ doua saptamani de la ingerarea unei doze zilnice de 0,2-0,3 mg OTA/kg GV.

Anatomopatologic se remarca leziuni de: hiperemia tosilelor, enterita hemoragica la nivelul ileonului, cecumului, colonului si rectului, rinichi de culoare maron deschisa cu necroza si descuamarea celulelor epiteliale din tubii renali proximali; se remarca de asemenea, necroza tesuturilor limfoide (splina, amigdale, timus, limfonoduli). Sursele de ochratoxina la caine sunt reprezentate de hrana uscata si laptele praf depozitate in conditii improprii. Carnea, in special carnea de porc si organele (ficatul, rinichiul) sunt principalele surse de OTA din hrana umeda.

O serie intreaga de referinte din literatura de specialitate prezinta procente ridicate de contaminare cu OTA, a hranei umede si uscate administrate in hrana animalelor de companie, in speta caini si pisici. Analiza ocratoxinei a din ser şi urina in vederea analizei micotoxicologice a ochratoxinei A din sange si urina s-a folosit metoda ELISA, utilizand kit-ul de analiza RIDASCREEN FAST Ochratoxin A (R-biopharm) si soft-ul de prelucrare date RIDAWIN/FOOD/211010. (Figura 1).

Pentru prelucrarea probelor a fost stabilit urmatorul protocol de lucru:

l Proba de urina a fost analizata dupa o prelucrare sumara constand in adaugarea a 1 ml NaHCO3 0,13 M; s-au luat in lucru 2 ml proba de analizat.

l Proba de sange a fost prelucrata pentru obtinerea serului; s-au luat 2 ml ser peste care s-au adaugat 2,5 ml HCl 1 N si 4 ml diclormetan (DCM); s-a omogenizat timp de 5 minute apoi s-a centrifugat timp de 15 minute la 3500 rot/min; s-a indepartat stratul superior apos apoi s-au luat din filtrat 2 ml peste care s-au adaugat 2 ml NaHCO3 0,13 M urmata de o omogenizare timp de 5 minute si centrifugare 5 minute; s-a colectat stratul superior si s-a lasat in alta eprubeta; peste filtrat s-au adaugat 2 ml NaHCO3 0,13 M, s-a omogenizat timp de 5 minute si apoi s-a centrifugat timp de 5 minute; s-a recoltat stratul superior de NaHCO3 si s-a adaugat peste stratul anterior de NaHCO3; peste cele doua straturi s-au adaugat 0,75 ml HCl si 2 ml DCM urmand o noua omogenizare si centrifugare; stratul superior s-a indepartat iar stratul de DCM a fost evaporat la 60 grade C; s-a adaugat 1 ml NaHCO3 0,13 M; in final s-au luat in lucru 50 μl/godeu.

Metoda este implementata si validata intern in cadrul unei clinici medicale umane si poate fi utilizata in egala masura in cabinetele medicale veterinare sau efectuata in laboratoarele de analiza micotoxicologica pe baza probelor de ser si urina recoltate de la animalele de companie. Analiza micotoxicologica a OTA din ser si urina este facila si evidentiaza relativ repede o posibila implicare a micotoxinei in patologia aparatului urinar, mai ales la animalele care consuma constant hrana comerciala umeda sau uscata, de calitate inferioara.

 

metode analiza3

Figura 1. Kit analiza micotoxine (R-biopharm) si soft prelucrare date RIDAWIN/FOOD/211010. MET

Dr. Simion Violeta-Elena

Dr. Negreanu Catalin

Biolog Rotaru Simona

Ultima modificareMarți, 31 Iulie 2018 19:27