promo lung iarna 2019 720
Autentificare
updated 9:31 AM UTC, Feb 17, 2019

Transferul de embrioni la vaca(IV) -Material seminal - examinare si pastrare- Estrul la femele

Contents[Hide]

Transferul de embrioni este o sursa importanta de profituri atat pentru medicul veterinar cat si pentru fermier. Continuam seria de articole despre transferul de embrioni inceput in numerele 17,18,19.

1. Examenul Spermei


Evaluarea spermei si fertilitatea Evaluarea spermei in relatie cu fertilitatea se face cel mai frecvent la taurine, si mai rar in cazul altor specii. Standardele minime utilizate pentru a clasifica un taur drept „probabil fertil" sunt: prezenta a peste 500 milioane spermatozoizi per ml, mai mult de 50% spermatozoizi cu miscari progresive de inaintare, peste 80% spermatozoizi cu morfologie normala. Daca vreunul dintre aceste trei criterii nu este satisfacut la analiza a cel putin trei ejaculate diferite, taurul este suspectat a fi infertil, insa doar in cazul in care spermatozoizii motili sunt complet absenti si aparatul reproductiv al taurului a fost atent examinat, taurul poate fi declarat steril. Evaluarea spermei trebuie sa se desfasoare rapid, astfel incat sa permita prelucrarea in vederea pastrarii calitatii initiale si fertilitatii. Nu exista un test unic care sa caracterizeze cu acuratete capacitatea fecundanta a unui ejaculat, insa combinarea atenta a rezultatelor mai multor teste, ofera criteriile necesare selectarii ejaculatelor cu capacitate fecundanta crescuta. Ejaculatele sunt analizate din punct de vedere al mai multor caracteristici, precum culoare, miros, vascozitate, pH, precum si al concentratiei, mobilitatii, anomaliilor etc., fiind utilizate criterii unitare de apreciere a rezultatelor obtinute (tabelul 1). Sperma trebuie sa aiba un aspect opac, relativ uniform, indicator al concentratiei crescute a spermatozoizilor.

transfer embrioni vaca tabel1


Probele translucide contin putini spermatozoizi. Proba de sperma trebuie sa nu contina par, particule straine sau fragmente de tesuturi (indicatoare ale infectiilor aparatului reproducator). Unii tauri produc sperma galbuie in mod frecvent, fapt datorat prezentei riboflavinei, complet inofensive (nu trebuie confundata cu urina, care are miros specific).

transfer embrioni vaca tabel2

 

In general, masculii tineri precum si cei apartinand speciilor de talie mica genereaza ejaculate mai reduse in volum. Ejacularea frecventa determina volume scazute, iar in cazul recoltarii consecutive a doua ejaculate, cel de-al doilea va avea in mod cert un volum mai redus. Volumul redus nu are neaparat semnifi-catie patologica, insa este acompaniat de o concentratie scazuta a spermatozoizilor.

2. Concentratia spermatozoizilor

Determinarea cu acuratete a numarului de spermatozoizi per mililitru de sperma este esentiala pentru stabilirea gradului si volumului de dilutie in vederea obtinerii unor doze de material seminal congelat de buna calitate. Concentratia poate fi determinata prin metoda numararii in camerele hemocitometrice de diferite tipuri, prin ci-tirea gradului de refractie, cu ajutorul refractometrelor, sau cu ajutorul programelor de computer (software specializat), care afiseaza instantaneu caracteristicile spermei.

3. Morfologia spermatozoizilor

In mod obisnuit, in sperma se evidentiaza prezenta unor spermatozoizi anormali, fapt care nu este asociat cu o afectare a fertilitatii, atat timp cat proportia acestora nu depaseste aproximativ 20%; chiar si in aceasta situatie, anumite tipuri de anomalii nu pot fi asociate cu infertilitatea. Aprecierea morfologiei spermatozoizilor se face consecutiv utilizarii anumitor coloratii (Papanicolau, albastru de metilen, eozina-nigrozina -pentru evidentierea spermatozoizilor morti si a anomaliilor cromozomiale, sau coloratii supravitale Kovacs-Foote, pentru evidentierea anomaliilor acrozomiale). Anomaliile morfologice ale spermatozoizilor pot fi primare, secundare sau tertiare. Anomaliile primare sunt generate de disfunctii aparute in spermatogeneza, in timp ce anomaliile secundare se instaleaza pe parcursul pasajului prin epididim. Afectarea spermatozoizilor pe parcursul ejacularii, consecutiv acesteia sau in timpul manevrelor de IA, genereaza anomaliile tertiare.

4. Anomalii mostenite ale spermatozoizilor

O larga varietate de defecte structurale ale spermatozoizilor pot cauza sterilitate sau fertilitate redusa la tauri si vieri, prin interferarea procesului fecundatiei. Unele dintre aceste defecte sunt mostenite, nefiind inca elucidat modul de transmitere. Defectul localizat la extremitatea anterioara a capului postnuclear, rezulta din invaginarea membranei nucleare si reprezinta un simptom al tulburarii spermatogenezei. Defectul numit „knob" (knobbed = cu noduri, lb. engleza, evidentiat in principal la taurii din rasa Friza, imprumuta forma unui acrozom, afecteaza toti spermatozoizii ejaculatului, iar masculul afectat este steril. Este un caracter mostenit, datorat unei gene autozomale recesive. Un defect ,,knob" similar a fost semnalat in sperma vierilor apartinand rasei Marele Alb. Spermatozoizii afectati nu sunt capabili sa fecundeze ovocitele. Defectul „decapitate" reprezinta o anomalie a cozii spermatozoizilor evidentiata in sperma taurilor Guernesey sterili. Este asociat unei anomalii ultrastructurale in regiunea gatului sau a regiunii de implantare a spermatozoidului. Acesti spermatozoizi anormali se dezintegreaza in fragmente izolate reprezentand capete sau cozi de spermatozoizi, evidentiabile in regiunea capului epididimului.

In cazul defectului „dag", evidentiat la taurii Jersey Danez, piesa principala este puternic spiralata si pliata peste piesa intermediara, conferind aspectul unei cozi mai scurte. Aparitia acestui defect se datoreaza nivelurilor crescute ale zincului in spermatozoizi, precum si in lichidul seminal. Alt defect detectat in sperma taurilor sterili din rasa Friza, acela al pseudo-picaturii, este caracterizat prin rasucirea sau ingrosarea piesei intermediare. Un defect rar intalnit, in special la taurii in varsta din rasa Rosie Daneza, este cel al piesei intermediare care are forma de tirbuson, evidentiat la 15-50% dintre spermatozoizi, care de altfel, sunt si morti.

5. Mobilitatea spermatozoizilor

Inalta specializare a celulei spermatice este pe deplin justificata de scopul unic al existentei sale, si anume acela de a fecunda ovocita. Pe parcursul deplasarii prin caile genitale ale masculului si mai apoi ale femelei, spermatozoizii strabat diferite medii in care trebuie sa supravietuiasca.

Mobilitatea, o caracteristica importanta a spermatozoizilor sanatosi, este esentiala pentru fecundatie, insa nu reprezinta obligatoriu un indicator al capacitatii fecundante. Spermatozoizii normali isi pierd capacitatea fecundanta inainte de a-si pierde mobilitatea. Cea mai simpla metoda de apreciere a mobilitatii spermatozoizilor este reprezentata de observatia vizuala, insa relevanta acesteia este scazuta. Este de asemenea posibila estimarea ratei mobilitatii spermatozoizilor prin utilizarea testului mucusului cervical. La microscop, prin intermediul acestui test, sunt evidentiabile modificarile miscarilor de inaintare, pe masura strabaterii filamentelor de glicoproteine din mucusul cervical, precum si aglutinarea consecutiva. Metodele fotoelectrice, electronice, precum si programele specializate disponibile pe computer, permit o apreciere precisa a mobilitatii spermatozoizilor, a traiectoriei acestora precum si a tipurilor de miscari evidentiate.

6. Aprecierea capacitatii fecundante a spermatozoizilor

Cel mai frecvent utilizat este testul penetrarii ovocitei de hamster (,,Zona- Free Hamster Ova Test"). Testul presu- pune prepararea si capacitarea spermei in vitro, superovularea femelelor de hamster, indepartarea zonei pellucida aferente ovocitei cu ajutorul tripsinei, incubarea spermei impreuna cu ovocitele denudate si in final, estimarea patrunderii spermatozoizilor in ovocite. Alt test, utilizat indeosebi in tehnicile de reproducere asistata la om, este testul „inflamarii hipoosmotice" („Hypo-osmotic swelling test"), care consta in punerea in contact a spermei, fructozei si citratului de sodiu 150 mOsm in solutie apoasa. Consecutiv incubarii timp de 30-60 de minute la 37°C, la microscopul cu contrast de faza se evalueaza proportia spermatozoizilor care prezinta coada modificata, in sensul cresterii diametrului acesteia. Bredbacka si col. (1997) propun utilizarea aprecierii morfologice a spermatozoizilor in combinatie cu fecundatia in vitro, drept modalitate de evaluare a fertilitatii taurilor. Pe scurt, sperma provenind de la un anumit mascul, este mai intai supusa examenului morfologic, iar mai apoi, utilizata pentru a fecunda in vitro ovocite provenite de la femele sacrificate la abator. Rezultatele acestui tip de test au fost ulterior confirmate prin utilizarea nemijlocita a materialului seminal congelat. Studiul lui Oettle (1993) a facut posibila corelarea caracteristicilor morfologice ale spermei cu fertilitatea, permitand astfel aprecierea indirecta a capacitatii fecundante a acesteia. Ca urmare, sperma care contine mai mult de 60% spermatozoizi normali este considerata o sperma de calitate buna, iar cea care contine mai putin de 60% spermatozoizi normali, nu poate asigura o fecunditate corespunzatoare (13% in studiul citat).

Se stie ca pentru fertilitatea masculului la specii diferite, precum Drosophila, soarece sau om cromozomul Y este esential (Vogt PH si col., 1998). La om, trei regiuni genomice ale portiunii eucromatice a bratului lung Y(Yqll) au fost identificate gazduind cel putin cate o gena importanta pentru fertilitate. Aceste regiuni Y au fost denumite regiuni ale Factorului Azoospermic („Azoospermia factor"): AZFa, AZFb si AZFc - deoarece barbatii cu deletia acestor segmente sufera de azoospermie. Fiecare deletie a uneia dintre regiunile AZF pare a fi asociata cu o histopatologie diferita. Acest aspect sugereaza ca genele Y sunt functionale pe parcursul unor faze diferite ale spermatogenezei. Cateva gene Y cu o functie potentiala in spermatogeneza sunt prezente in fiecare regiune AZF. Analizele lor moleculare au relevat existenta a doua tipuri: genele Y cu copii multiple pe cromozomul Y exprimate doar in tesutul testicular (grupa I); gene Y cu o copie omoloaga a genei pe cromozomul X, exprimata in mai multe tesuturi. Despre unele dintre genele grupului I (RBM, DAZ) s-a demonstrat ca provin dintr-un omolog autozomal. Unele dintre genele apartinand ambelor grupe sunt incluse pe bratul scurt al cromozomului Y, aspect evidentiat la soarece.in mod evident, cromozomul Y al mamiferelor reprezinta un sanctuar pentru genele care contribuie la reteaua genetica care controleaza linia seminala precum si fertilitatea masculului.

7. CONSERVAREA SPERMEI

7.1. Crioconservarea

Tehnica de conservare a spermei a fost revolutionata in urma cu aproximativ 50 de ani (Holt, 2000), cand s-a evidentiat faptul ca glicerolul are o actiune crioprotectoare. Aceasta observatie esentiala a permis congelarea spermatozoizilor, depozitarea lor pentru perioade indelungate si apoi utilizarea lor cu succes pentru insamantarile artificiale. Datorita faptului ca si cele mai performante tehnici de crioconservare induc criomodificari letale si subletale, nu este surprinzator ca eficienta transportului spermatozoizilor prin tractul genital femel poate fi drastic redusa consecutiv crioconservarii. Raspunsul celular la crioconservare si crioprotectori Atunci cand celulele ingheata, sunt supuse stresului rezultat in urma interactiunii dintre apa si constituentii celulari, care apar pe parcursul formarii cristalelor de gheata.

Cristalizarea induce formarea unor incluziuni necongelate de solutii hiperosmotice, in timp ce procesul de racire catre temperatura de -50°C este in desfasurare. Studii electronomicroscopice efetuate pe spermatozoizi in diluant congelat au aratat ca unele celule sunt excluse din spatiul ocupat de catre cristalele de gheata, prin aceasta fiind expuse in mod deosebit la mediul anizoosmotic. Acest proces va conduce la extragerea apei intracelulare, deformarea consecutiva a celulei si posibilul influx de ioni. Decongelarea presupune fenomenele inverse, iar intrarea apei in celula poate genera rupturi ale membranei celulare. Deoarece inghetarea prea rapida poate duce la formarea intracelulara a cristalelor de gheata, ce au un efect letal, se considera ca rata optima de congelare este aceea care este suficient de lenta pentru a preveni formarea cristalelor de gheata, dar suficient de rapida pentru a minimiza efectele daunatoare ale expunerii prelungite la concentratiile crescute de saruri.

Utilizarea solutiilor de saruri reprezinta metoda standard recomandata de literatura pentru metodele analitice de separare a proteinelor periferice de pe suprafata celulei. Expunerea spermatozoizilor la solutii hipertonice formate de catre cristalele de gheata in dezvoltare inseamna ca practic, acestia vor fi afectati prin inlaturarea proteinelor membranare pe parcursul acestei faze a crioconservarii, in cazul in care procesul se desfasoara prea lent. Deoarece magnitudinea fluxului de apa este dependenta de rata de racire, valorile optime ale fluxului de apa ar trebui sa fie deductibile prin calcularea ratei optime de racire. Daca aceasta observatie si-a gasit confirmarea in procesele de congelare a ovocitelor si embrionilor, lucrurile stau diferit in cazul spermei.

Astfel, calcularea fluxului de apa depinde de modificarile parametrilor specifici membranei, conductivitatii hidraulice si energiei activate, insa datorita faptului ca spermatozoidul este o celula complexa, acesti parametri pot varia in diferitele domenii de membrana ale suprafetei spermatozoizilor. In plus, modificarile survenite in aglomerarile de lipide membranare pot induce variatii dependente de temperatura ale parametrilor respectivi, iar crioprotectorii, indeosebi glicerolul, sunt recunoscuti pentru capacitatea lor de a interactiona cu lipidele membranare, afectand in acest mod parametrii corespunzatori.

7.2. Caracteristici de specie ale susceptibilitatii spermatozoizilor la crioalterari

A fost cu prisosinta demonstrat rolul exercitat de caracteristicile osmotice si chimice ale mediilor de conservare in supravietuirea spermatozoizilor. Alegerea solutiilor tampon, natura crioprotectantilor si a aditivilor precum zaharurile, chelatii de calciu, antioxidantii, a proteinelor din lapte si galbenusului de ou si-au dovedit influenta capitala in afectarea capacitatii de supravietuire a spermatozoizilor. Aceste substante indeplinesc in mod cert alte roluri decat acela de a modifica permeabilitatea membranei celulare a spermatozoizilor fata de apa, ceea ce ar putea explica diferentele inregistrate intre rezultatele obtinute la variate specii. in aceasta directie, merita luate in discutie variabilitatile de specie referitoare la efectele benefice sau nefaste ale glicerolului. in mod frecvent, spermatozoizii de taur sunt crioconservati utilizand glicerol in concentratii de 4-8%, find obtinute rezultate multumitoare atunci cand aceste concentratii au fost folosite si pentru conservarea spermei rumegatoarelor salbatice (cervidee si bovine, Holt -2000).

Spermatozoizii de vier sufera deprecieri acrozomiale grave in cazul in care concentratia glicerolului depaseste 3%, iar la rozatoare, spermatozoizii sunt distrusi de glicerolul aflat in concentratii cu valori mai mari de 1,75%; in schimb, rezultatele optime in conservarea spermei de chinchilla au fost obtinute in cazul utilizarii glicerolului 6%. Aceste diferente pledeaza in favoarea implicarii glicerolului preponderent in afectarea structurii si functiilor membranei si mai putin in modificarea permeabilitatii acesteia. Este posibil ca glicerolul sa influenteze fluiditatea membranei, prin intercalarea sa intre cele doua straturi de lipide, precum si vascozitatea citoplasmatica intracelulara, afectand toate reactiile metabolice. A fost pusa in discutie chiar afectarea interactiunilor dintre proteinele citoscheletului si cele ale membranei spermatozoidului de soarece, de catre glicerol. in acest context, efectele potential disruptive au fost considerate drept benefice, deoarece a fost ameliorata toleranta la stresul osmotic asociata fluxurilor de apa. in mod evident, crioconservarea implica expunerea la temperaturi foarte scazute, complet nefiziologice, chiar inaintea producerii inghetarii. Acest proces induce modificari bidimensionale in organizarea membranara (transformari de faza ale lipidelor) si consecutiv, transformari ale proprietatilor kinetice ale enzimelor intramembranare. Implicit, fusogenitatea membranei si raspunsurile la caile de traducere a semnalelor pot fi afectate de aceste modificari, marind probabilitatea ca longevitatea spermatozoizilor post decongelare sa fie redusa datorita procesului accelerat de capacitare. in ideea corelarii susceptibilitatii membranei la crioalterare cu compozitia lipidica a membranei la diferite specii, s-a demonstrat ca socul termic, fenomen prin care crioalterarea este indusa prin racirea brusca, fara congelare, este mult mai drastica atunci cand concentratiile sterolice ale membranei spermatice sunt scazute, iar concentratiile acizilor grasi nesaturati sunt crescute. Faptul ca toleranta la stresul osmotic aparut pe parcursul adaugarii sau inlaturarii substantei crioprotectoare poate ajuta la prevederea capacitatii de supravietuire a spermatozoizilor consecutiv crioconservarii, poate fi apreciat in doua moduri. Mai intai, demonstreaza ca diferentele in structura membranara, permeabilitate si elasticitate determina limita pana la care spermatozoizii vor supravietui procesului de crioconservare. La nivel tehnic, aceasta informatie sugereaza ca supravietuirea spermatozoizilor poate fi optimizata prin evitarea sau mi- nimizarea efectelor socului osmotic pe cat mai mult posibil. Mai apoi, trebuie subliniat faptul ca tehnica optima, care implica atat adaugarea cat si indepartarea graduala a glicerolului intr-o succesiune de aproximativ opt etape (crescatoare, respectiv descrescatoare), permite recuperarea a aproximativ 90% dintre spermatozoizii vii. Aceasta tehnica este deosebit de utila in cazul prelucrarii spermei de slaba calitate, provenita de la indivizi supusi unor tratamente care au printre efectele secundare, si afectarea caracteristicilor spermei.

Componentele care asigura un bun mediu de diluare a spermei trebuie sa prezinte urmatoarele calitati:

  • (a) sa asigure nutrienti, drept sursa de energie;
  • (b) asigurarea protectiei impotriva actiunii daunatoare exercitate de racirea rapida;
  • (c) sa reprezinte un tampon capabil sa previna modificarile nocive ale pH-ului, rezultate in urma generarii acidului lactic;
  • (d) mentinerea presiunii osmotice si a echilibrului electrolitic optime;
  • (e) inhibarea dezvoltarii bacteriilor;
  • (f ) sporirea volumului spermei, in asa fel incat sa poata fi utilizata pentru mai multe inseminari;
  • (g) sa protejeze celula spermatica pe parcursul procesului de congelare (Hafez, 1993).

Sperma de taur este in mod obisnuit diluata cu solutie de galbenus de ou citratat, lapte integral sau ecremat sau solutie de lactoza, fiind conservata cu succes in diluanti organici precum Tris, TES, MES, sau HEPES. In vederea controlului proliferarii oricaror contaminanti microbiologici, se impune adaugarea antibioticelor, considerandu- se ca amestecul penicilina / streptomicina confera un spectru suficient de larg pentru atingerea scopului propus. De asemenea, se recurge la adaugarea glicerolului, drept crioprotector. si prezenta dimetilsulfoxidului (DMSO) sau a lactozei in diluant au o actiune benefica, servind ca agenti de deshidratare. insamantarile artificiale efectuate la scroafe cu sperma de vier congelata au generat fertilitate scazuta precum si un numar redus de produsi.

Fecunditatea scazuta a spermei congelate poate fi rezultatul unui interval scazut de supravietuire a spermatozoizilor (consecutiv decongelarii) in uter, jonctiunea utero- tubara si oviducte, comparativ cu situatia intalnita in cazul spermei proaspete. Sperma bruta contine in medie 150 de milioane de spermatozoizi pe ml. in vederea congelarii, este necesara atingerea unei concentratii de 1 miliard de spermatozoizi in 0,5 ml (cat este volumul paietei), lucru posibil doar prin centrifugare. Consecutiv centrifugarii, se elimina o mare proportie a plasmei seminale (care este toxica pentru spermatozoizi), rezultand o concentratie crescuta a spermatozoizilor in sediment. Ulterior, aceasta poate fi rediluata la concentratia dorita. in prezent nu exista alta metoda care sa permita prelucrarea materialului seminal pentru congelare, cercetarile asidue permitand elaborarea unui protocol optim de centrifugare (din punct de vedere al diluantului - Glucoza EDTA, Glucoza Hepes, citrat EDTA; intensitatii - 400 la 1000g,si timpului - 5 la 15 minute), care sa diminueze influenta negativa exercitata de centrifugare asupra spermatozoizilor. Tentativele de identificare a unor metode variate de obtinere a unei concentratii mari de spermatozoizi mobili in volum cat mai redus, au condus la adaptarea unor metode de spalare-filtrare a materialului seminal utilizate in medicina umana, cum ar fi filtrarea prin coloana de Sephadex sau filtru Leucosorb L4. Filtrul de Sephadex retine spermatozoizii cu defecte de acrozom, precum si pe cei cu mobilitate scazuta, fenomene explicabile prin capacitatea Sephadexului de a cupla membrana celulei spermatice printr-o proteina cu structura asemanatoare cisteinei.

Limitele acestei metode o fac utila pentru obtinerea unui ejaculat cu caracteristici superioare, sau pentru ameliorarea ejaculatelor necorespunzatoare, neputand fi utilizata ca substitut al centrifugarii. O alta metoda utilizabila pentru ameliorarea caracteristicilor ejaculatului (fara a inlocui insa centrifugarea) este cea bazata pe filtrul Leucosorb L4, filtru de membrana utilizat in medicina umana pentru adsorbtia leucocitelor. Valentele acestui filtru in reproducerea asistata au fost evidentiate in 1991 (pentru sperma de barbat) si 1996 (pentru cea de armasar), subliniindu-se ca in urma filtrarii rezulta un material seminal liber de detritusuri celulare si leucocite, precum si o populatie de spermatozoizi normali din punct de vedere morfologic.

Ultima modificareSâmbătă, 04 August 2018 20:06
Gabriel Fratila

medic veterinar primar.