Autentificare
updated 5:56 PM UTC, Nov 20, 2019

Imunofluorescenta indirecta, in diagnosticul bolilor infectioase, parazitare si autoimune la animalele de companie

Rezumat: Un diagnostic corect este baza unui tratament eficient. Stiintele medicale si biologice au evoluat extrem de mult, descoperindu-se noi si eficiente metode de diagnostic,dar care, din motive tehnice, de costuri sau acceptanta a clinicianului sunt greu de implementat. Metodele clasice cunoscute si larg acceptate, sunt permanent imbunatatite, in sensul cresterii sensibilitatii si specificitatii lor, acesti parametri statistici caracterizand acuratetea testelor de laborator. In alegerea unei metode de diagnostic, clinicianul trebuie sa tina cont de aceste variabile. Sensibilitatea exprima procentul de cazuri depistate pozitive din numarul total de cazuri pozitive, sau altfel spus, test pozitiv la un animal bolnav. Specificitatea exprima procentul de cazuri depistate negative din numarul total de cazuri negative, sau altfel spus, test negativ la un animal fără boala.

O larga utilizare in laboratorul clinic il au reactiile imunochimice- precipitarea, aglutinarea, neutralizarea, cele care utilizeaza complementul, reactiile cu reactivi marcati, tehnica Western Blot. Cele mai utilizate metode se bazeaza pe reactia Ag-Ac. J. F. Bach defineste antigenele ca fiind molecule care, consecutiv introducerii in organism pe o cale adecvata, induc un raspuns imun materializat prin proliferarea celulelor limfoide si sinteza moleculelor de recunoastere (anticorpi si receptori celulari), cu care se combina in vivo si in vitro.

Anticorpii sunt imunoglobuline care se sintetizeaza in organism dupa patrunderea unui antigen si au proprietatea de a se cupla specific cu antigenul inductor si de a-i anihila actiunea nociva. Exista mai multe clase de imunoglobuline-G, M, A, E si D. Imunoglobulinele reprezinta circa 20% din totalul proteinelor serice. IgG este dominanta cantitativ in serul normal, reprezentand 70-75% din cantitatea totala de imunoglobuline. IgG se sintetizeaza tardiv in raspunsul imun primar, dar este imunoglobulina predominanta a raspunsului imun secundar si se distribuie uniform in compartimentele intra si extravasculare. Este sintetizata dupa remisia fazei acute a bolii si in anumite cazuri, persista toata viata pacientului, avand rol protector. Nu toate bolile produc imunitate permanenta, in cazul lor, timpul de injumatatire al IgG fiind de 21 de zile, acest fapt fiind un indicator al sanarii procesului infectios. IgG este singura imunoglobulina care traverseaza placenta, asigurand astfel protectia fetusului si a puiului in prima luna de viata.

Ig M este receptorul major de antigen pe suprafata limfocitelor B mature, reprezentand 5-10% din cantitatea totala de anticorpi serici, fiind principala opsonina imunoglobulinica a serului, sintetizandu-se in primele faze ale raspunsului imun primar fata de un antigen, ca rezultat al activarii policlonale nespecifice a limfocitelor B si leaga o varietate de antigene: virusuri, bacterii, fungi, protozoare si paraziti. IgM trece greu sau nu trece in lichidele interstitiale si nici  prin bariera placentara.    

Pentru determinarea diferentiata de IgG si IgM, cele mai adecvate sunt testele ELISA, imunofluorescenta si Western Blot.

Imunofluorescenta are o sensibilitate de 100 de ori mai mare decat reactia de fixare a complementului, o mare specificitate, posibilitatea determinarii calitative si cantitative. Este o metoda care imbina microscopia cu tehnicile serologice de decelare a anticorpilor, fiind folosita cu succes in determinarea precoce a bolilor virale, a unor boli bacteriene, parazitare si chiar autoimune. Are cel mai scurt timp de lucru, prelucrarea si examinarea unui set de  probe durand  ceva mai mult de o ora.
Metoda imunofluorescentei prezinta aceleasi erori ca si celelalte reactii imunologice: prezenta antigenelor comune, responsabile de reactiile incrucisate, adica reactii fals pozitive, ca si neaparitia sau aparitia slaba de anticorpi, respectiv reactii fals negative.

In reactia de imunofluorescenta , unul dintre reactanti (Ac sau ag de cercetat) trebuie sa constituie o parte dintr-o structura biologica (tesut sau celula), reactivul marcat cu fluorocrom relevand reactia Ag-Ac. Imunofluorescenta poate fi directa, indirecta sau cu fixarea complementului. Metoda directa se foloseste numai in scop de seroidentificare. Metoda indirecta poate fi utilizata pentru seroidentificare si serodiagnostic.

In cazul imunofluorescentei indirecte, proba de analizat este reprezentata de plasma sau ser. Personal prefer prelucrarea probei din plasma, proba trimisa fiind reprezentata de sange recoltat pe EDTA, cu respectarea tehnicii de venopunctie si recoltarea in vacutainer vidat, prin fluturas. Proba recoltata pe EDTA imi permite, daca este cazul, verificari suplimentare prin efectuarea de frotiuri colorate panoptic sau microscopie in camp intunecat.

In laborator am pus un accent deosebit pe diagnosticarea bolilor zoonotice precum boala de Lyme, chlamidioza, bartoneloza, toxoplasmoza.

In acest sens, putem diagnostica, cu maxima acuratete boala de Lyme la caine si pisica, cu precizarea tulpinii borreliene implicate- Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii. In cazul bolii de Lyme se aproximeaza ca doar 5% dintre animalele seropozitive dezvolta simptome, insa consider necesar ca proprietarii sa fie informati asupra starii de sanatate a animalelor lor si a masurilor de precautie pe care sa le ia pentru propria protectie, aici referindu-ma in primul rand la  deparazitarea externa corecta a animalelor detinute, pentru a preveni o eventuala transmitere a acestei boli de la animal prin insecte hematofage. In cazul animalelor simptomatice, confirmate serologic, eficacitatea tratamentului se poate urmari prin verificarea titrului de anticorpi, care trebuie sa scada progresiv. Borrelioza, nefiind o boala care sa produca imunitate durabila, un animal vindecat total este acela care nu pozitiveaza nici un test serologic, fie IgM, fie IgG. Acest deziderat este insa, extrem de greu de realizat, in parte datorita rezistentei bacteriene, agresivitatii tratamentului si posibilitatii de reinfectare, scopul principal fiind amendarea simptomelor.

     
Borrelia burgdorferi

Borrelia burgoferii

Borrelia afzelii

Borrelia afzelii

Borrelia garinii

Borrelia garinii

Chlamidioza este o boala care afecteaza multe specii de animale si omul. In general ne axam pe diagnosticarea ei la pisici cu simptome respiratorii si oculare, insa ea poate afecta si cainii. La cainii sanatosi seroprevalenta poate ajunge chiar la 50%. Cainii bolnavi pot manifesta simptome asemanatoare bolii Carre, putand evolua ca o infectie sistemica acuta, subacuta sau cronica, tineretul fiind afectat mai sever. Semnele clinice includ febra, bronhopneumonie, peritonita, inapetenta, voma, diaree si leziuni cutanate. Titruri inalte de anticorpi antichlamidia sunt prezente, in lipsa pozitivarii testelor pentru boala Carre. Alte simptome pot fi reprezentate de conjunctivita, encefalite, artrite septice, ateroscleroza.

Chlamydia psittaci

Chlamydia psittaci

Genul Bartonella include 22 de specii, din care 13 specii intereseaza predominant medicina veterinara. Cea mai importanta specie este B. henselae, descoperita in 1990, semnificatia ei crescand continuu, fiind cauzatoarea „bolii zgaraieturii de pisica”. Sunt izolate doua serotipuri, coinfectiile fiind rare. In Germania, nivelul infectiei la pisicile de apartament este de 13%, pe cand la cele de strada depaseste 70%. B. henselae se presupune ca se transmite de la o pisica la alta prin intermediul puricilor.

Cainii prezinta simptome si anormalitati patologice mai pronuntate decat pisicile, incluzand febra, endocardita si miocardita, limfadenita granulomatoasa, encefalita, aritmii cardiace, rinita granulomatoasa si epistaxis. La caini si oameni, endocardita asociata bartonelozei implica de obicei valvele aortice si este caracterizata de leziuni vegetative masive.

Testele pentru decelarea anticorpilor anti Bartonella henselae pot da reactii incrucisate cu B. quintana, B. clarridgeiae, B. bacilliformis si Afipia felis.

Bartonella henselae
 Bartonella henselae 

Protozoarul Toxoplasma gondii este agentul cauzal al toxoplasmozei, zoonoza raspandita in toata lumea. Gazda finala animala este pisica sau alte felide, parazitul traind in celulele intestinale si  generand oochisti in faza de dezvoltare sexuata.Contaminarea altor mamifere si a omului se realizeaza pe cale fecal-orala, prin ingestia de apa sau alimente contaminate cu materii fecale care contin oochisti sau prin consum de carne cruda provenita de la animale infectate (carnea cruda a animalelor infectate contine chisti cu trofozoiti viabili).

De obicei, la pisica infectia evolueaza asimptomatic, exceptie facand puii infectati perinatal, care pot dezvolta simptome severe,si pot muri. Proliferarea intestinala a parazitului poate cauza diaree. Infectia extraintestinala afecteaza frecvent plamanii, ficatul, SNC, pancreasul si ochii, pisicile prezentand letargie, anorexie, febra, icter, dispnee, ataxie sau uveita.

Diagnosticul este dificil deoarece simptomatologia nu este foarte caracteristica, oochistii sunt rareori detectati in fecale, iar perioada de excretie este scurta. morfologic, ei seamana cu oochistii de Hammondia sau Besnoitia.

Detectia anticorpilor specifici in plasma sau ser utilizand imunofluorescenta indirecta este o metoda importanta de diagnostic.

Toxoplasma

Toxoplasmoza

Capitolul bolilor autoimune la animalele de companie incepe sa fie foarte studiat, in activitatea clinica intalnind din ce in ce mai multe cazuri de lupus eritematos sistemic (LES) sau boli asociate, in special la caini. Simptomele LES la caine includ poliartrita noneroziva, leziuni cutanate, febra de origine necunoscuta, glomerulonefrita, anemie hemolitica, trombocitopenie, polimiozita si manifestari neurologice. Anticorpii antinucleari (ANA), adica autoanticorpi impotriva nucleilor celulari apar la 97-100% din cainii cu LES, adesea cu titruri inalte. Animalele sanatoase si cainii cu infectii precum cele cu Bartonella vinsonii, Ehrlichia canis sau Leishmania infantum pot determina titruri scazute de ANA. In formele usoare de lupus discoid sau in cele cutanate de LES, fara afectari sistemice, detectia ANA este negativa in majoritatea cazurilor.

Ciobanescul german are o predispozitie de rasa evidenta, „furnizand” 32-47,6% din cazuri.

La caini, si la oameni, rezultatele ANA pozitive, ca si simptomele  de LES pot fi reversibile dupa tratamentul cu anticonvulsivante (fenitoin), antiaritmice (procainamida), antihipertensive (hidralazina), antimicotice (griseofulvina) si unele antibiotice (de exemplu tetraciclina).

In prezent, imunofluorescenta indirecta care utilizeaza celule HEp-2 este metoda de ales pentru detectia ANA la caini. Line-blot-urile utilizate in diagnosticul uman nu pozitiveaza multe probe canine care sunt ANA pozitive la imunofluorescenta indirecta, ceea ce indica diferenta de tinta antigenica.

Imagine ANA pozitiv

Imagine ANA pozitiv

Aplicatiile imunofluorescentei indirecte in medicina veterinara sunt extrem de generoase, prin aceasta tehnica putandu-se diagnostica si anaplasmozele, ehrlichiozele, bruceloza, boala Carre, herpesvirozele, coxiella, parvoviroza, criptococoza, encefalitozoonoza, leptospiroza, diverse rickettsioze, tularemia, panleucopenia, caliciviroza etc.

Important de mentionat este diagnosticul encefalitei virale transmise de capusa (TBEV) si posibilitatea confirmarii diagnosticului babesiozei cu Babesia gibsoni.

 

Bibliografie:

1, Mihaescu Gr., Chifiriuc C., Ditu L  Imunobiologie Ed. EUB, Bucuresti, 2009, pag 25-93

 

  • Sursa foto toxoplasma: Megacor
  • Sursa foto ANA: Caulton S
  • Sursa foto Borrelia, Chlamydia, Bartonella-din lucrarile proprii

 

 

        

Ultima modificareLuni, 18 Martie 2019 16:55