Microbiologia Rumenului si valoarea nutritiva a acestuia

Totodata, pH-ul lichidului ruminal variaza intre 6,5 si 7,2 (dupa alti autori intre 5,8 si 6,2), iar aceste valori sunt puternic influentate de tipul de alimentatie (de exemplu, subalimentatia sau supraalimentatia cu amidon poate reduce drastic valoarea pH-ului si poate afecta chiar sanatatea vacilor). O productie zilnica de 75 – 110 litri saliva (de asemenea influentata cantitativ de alimentatie) contribuie prin continutul in bicarbonat la asigurarea unui pH in limite normale. In general, la nivelul rumenului exista o populatie de 108 – 1010 microorganisme/g lichid ruminal, cele mai comune fiind bacteriile gram pozitive (coci si bacili). Microorganismele din microbiota ruminala sunt reprezentate de 1010 – 1011 bacterii/ml, 104 – 106 protozoare ciliate/ml, 103 – 105 fungi anaerobi/ml si 108-109 bacteriofagi/ml. Intre acestea exista relatii sinergice, antagonice sau neutre. Produsii de metabolism ai acestora creeaza un mediu in care pot supravietui cu totii. In timp ce unele microorganisme sunt dependente de altele si se hranesc reciproc, altele contin sau elibereaza componente antinutritionale care pot suprima cresterea si dezvoltarea altor microorganisme. Astfel, rumenul este un sistem stabil si in acelasi timp dinamic, cu o capacitate remarcabila de a transforma o materie organica - „iarba’’ intr-o materie anorganica – AGV (acizi grasi volatili), forma importanta de energie pentru rumegatoare.

1. Bacteriile ruminale

Bacteriile ruminale (majoritatea gram negative si anaerobe) necesita pentru a creste si a-si desfasura activitatea un pH cuprins intre 6,0 – 6,9 si o temperatura de 39ºC [7]. In general, acestea se hranesc cu continut ruminal compus din celuloza, lignina, amidon, grasimi si proteina.

Intrucat celuloza este principalul compus chimic care se gaseste in cantitate semnificativa in hrana rumegatoarelor, cea mai mare parte a microsimbiontilor ruminali anaerobi sunt „specializati’’ in descompunerea acesteia: Ruminococcus albus, R. flavefaciens (peste 50%), Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium lochheadii etc [6,7,10]. Dintre speciile de bacterii cu o activitate importanta se mai remarca Prevotella bryantil, o bacterie gram negativa care utilizeaza polizaharidele solubile precum xilanii in bioconversia lignocelulozei in AGV [7].

Cercetarile au demonstrat de asemenea ca activitatea bacteriilor celulozolitice este imbunatatita atunci cand rumegatoarele primesc in hrana drojdii precum Saccharomyces cerevisiae; acestea elibereaza nutrienti care sunt apoi utilizati de catre bacteriile celulozolitice. Un alt organism precum Treponema bryantil – o spirocheta zaharolitica – descompune celuloza fara insa a utiliza produsii rezultati. Activitatea de descompunere a celulozei de catre aceste spirochete este intensificata pe masura ce bacteriile celulolitice descompun peretele celular in zaharuri solubile.

Alti microsimbionti importanti sunt reprezentati de archebacterii: Methanobrevibacter ruminantium, Methanobacterium formicicum, Methanosarcina barkeri, Methanomicrobium mobile. Archebacteriile sunt organisme celulare rezistente la conditii extrem de dure (lipsite de oxigen), diferite de bacterii (eubacteria), fara peptidoglicani in peretele celular, sunt imobile si se hranesc prin chemosinteza (bacterii metanogene). Bacteriile metanogene sunt in cantitate de 107 – 109 celule/ml lichid ruminal, numarul acestora fiind influentat de hrana, in special de continutul in celuloza al acesteia. Marele dezavantaj al bacteriilor metanogene este reprezentat de productia de metan, peste 15% din emisia anuala fiind datorata rumegatoarelor.

Bacteriile metanogene sunt obligatoriu anaerobe, cresc intr-un mediu gazos continand un amestec de H2 si CO2 [1] au o activitate crescuta a nitrat reductazei [9]. Methanobrevibacter ruminantium utilizeaza ca substrat de crestere H2 si in egala masura CO2 si necesita in particular o concentratie crescuta de acetat ca si de acizi grasi cu lant ramificat (acizi grasi omega 3, de exemplu). Ca multe alte bacterii, nici acestea nu produc endospori; temperatura optima de dezvoltare este de 40ºC si un pH cuprins intre 6,1 – 6,9 [1]. Bacteriile metanogene pot avea relatii neutre la nivelul rumenului sau relatii simbiotice cu diferite protozoare de care stau atasate pentru a obtine hidrogenul de care au nevoie: Entodinium longinucleatum, Eudiplodinium maggii, Entodinium bursa si Eremoplastron bovis. In absenta protozoarelor ciliate, metanogeneza este redusa considerabil.

2. Protozoarele

Protozoarele din rumen contribuie la peste 50% din totalul biomasei microbiene ruminale [12], compozitia acestora fiind corelata cu tipul de alimentatie si specia de rumegatoare. In functie de micro- si macronuclei, de prezenta si morfologia spinilor si lobilor externi sau a placilor interne scheletice ca si de forma si marimea celulei (Dogiel 1927, Ogimoto si Imai 1981, Williams si Coleman 1992) [12], sunt recunoscute la rumegatoare cinci tipuri majore de protozoare: Isotricha, Diplodinium, Entodinium, Epidinium si Ophryoscolex (figura 1).

Figura 1: Protozoare ruminale

De asemenea, pot fi clasificate in functie de substratul utilizat, in protozoare care consuma zaharuri solubile, amidon sau lignoceluloza, acest lucru fiind posibil datorita unui echipament enzimatic foarte bine dezvoltat (amilaza, invertaza, pectinesteraza, poligalacturonaza) [12]. Enzimele responsabile de degradarea celulazei si a hemicelulazei sunt produse in special de protozoarele entodiniomorfe si mai putin de cele holotriche. Protozoarele avand dimensiuni mari digera si degradeaza polimerii structurali ai plantelor in timp protozoarele de dimensiuni mai mici digera predominant zaharurile [8].

Protozoarele au capacitatea de a sintetiza acizi cu lant lung utilizand ca precursori substante din lichidul ruminal precum si capacitatea de a metaboliza si sintetiza proteine microbiene si proteine rezultate din hrana; acest lucru este cu atat mai remarcabil cu cat protozoarele sunt capabile sa sintetizeze aminoacizi care pot lipsi din structura proteinei alimentare. Un alt aspect important este digestibilitatea proteinei sintetizate de protozoare, mai mare comparativ cu cea produsa de bacteriile ruminale. O cantitate insemnata din aceasta proteina, aproximativ jumatate, contine constant patru aminoacizi: acidul glutamic, leucina, lizina si izoleucina [2]. Protozoarele sunt strans asociate de particulele de hrana.

Holotrichele manifesta chimiotaxie deplasandu-se catre zona posterioara a rumenului cand animalul se hraneste, inainte de a ajunge in sacul ventral sau dorsal. Toate protozoarele depoziteaza glucide solubile sub forma amilopectina ca si polizaharide (componentele amidonului sunt amiloza si amilopectina) si au specificitate pentru zaharuri: holotrichele depoziteaza zaharuri solubile in timp ce oligotrichele depoziteaza amidon. Glucidele sunt surse permanente de energie pentru protozoare in timp ce pentru animal, asigura fermentatia. Holotrichele din apropierea peretelui ruminal sunt consumatoare de O2. Protozoarele inghit/consuma si lizeaza bacteriile, contribuind la turnover-ul proteic al rumenului si au relatii strans apropiate cu bacteriile metanogene.

Produsii finali de fermentatie ai protozoarelor holotriche sunt: acidul acetic, acidul butiric, acidul lactic si H2 in timp ce ai oligotrichelor sunt: CO2, H2, acidul acetic si acidul butiric. Aceste organisme nu folosesc ca sursa de hrana NH3 insa sunt activ proteolitice.

3. Bacteriofagii

Bacteriofagii sunt virusi ai bacteriilor, avand specificitate pentru acestea si au fost identificati in rumen in cantitati importante. Acestia ajuta indirect, punand la dispozitia organismului animalului o sursa de aminoacizi, prin liza celulei bacteriene.

4. Fungii

Identificati pentru prima data de catre Orpin in 1975, sunt recunoscuti astazi ca avand un rol activ si pozitiv totodata in degradarea fibrelor vegetale, activitate evidentiata in special prin prezenta diferitelor enzime in substrat. Cercetarile de microscopie electronica au demonstrat ca acesti fungi, obligatoriu anaerobi, se ataseaza de tesuturile lignificate si, prin enzimele produse (proteaza, esteraza, celulaza, hemicelulaza), degradeaza lignoceluloza mult mai eficient decat bacteriile.

Dintre speciile de fungi intalnite la vaci se remarca: Neocallimastix frontalis, N. hurleyensis, Sphaeromonas communis (Caecomyces communis), Orpinomyces bovis, Anaeromyces mucronatus (Ruminomyces mucronatus), Ruminomyces elegans. Wallace [11] demonstreaza ca adaugarea in hrana a unui extract de Saccharomyces cerevisae si Aspergillus oryzae determina o crestere a viabilitatii bacteriilor celulozolitice care conduce in final la cresterea debitului de azot de origine microbiana absorbit la nivelul tubului digestiv.

5. Influenta alimentatiei rumegatoarelor asupra compozitiei microsimbiontilor ruminali

Ratia de hrana are o influenta majora asupra populatiei de microsimbionti.

Majoritatea bacteriilor ruminale sunt gram-negative insa cercetarile au evidentiat ca odata cu cresterea densitatii energetice a ratiei, creste si numarul bacteriilor gram pozitive. Acizii volatili constituie o sursa importanta de energie pentru rumegatoare. Cercetarile au aratat ca productia totala de acizi in rumen a fost mai mare in situatia hranirii animalelor cu siloz decat a celor hranite cu fan. Hranirea cu fan determina cresterea concentratiei de acid acetic in rumen dar reduce cantitatea de acid propanoic a carui productie este legata de continutul ridicat in glucide din furaje. Totodata s-a observat ca numarul de bacterii ruminale a fost mai mare la animalele hranite cu siloz decat la cele cu fan.

La vacile hranite cu ratii diferite, s-au observat in urma cercetarilor, variatii ale numarului protozoarelor de la sub 1% pana la 70% din totalul acestora. Dintre tipurile de furaje, ca si in cazul bacteriilor ruminale, s-a dovedit ca fiind cel mai eficient in cresterea numarului protozoarelor, silozul de porumb [3]. Reducerea cantitatii de hrana administrata a redus de asemenea numarul protozoarelor ruminale desi, in unele cazuri a fost observata o crestere a numarului de holoriche comparativ cu celelelate.

6. Factorii care afecteaza protozoarele ruminale

1. Compozitia hranei O cantitate mare de apa/lichid in hrana dilueaza cantitatea de protozoare.
2. Frecventa hranirii animalului: influenteaza direct proportional cresterea cantitatii de protozoare ruminale. Depopularea se poate produce datorita unor substante precum: CuSO4, detergenti, lecitina sau acid linoleic, tanini, saponine. Studii privind textura hranei administrate au demonstrat ca hrana peletata, datorita unui tranzit mai rapid la nivelul tubului digestiv, nu favorizeaza cresterea numarului de fungi anaerobi in rumen; de asemenea, s-a observat ca o cantitate mai mare de zaharuri solubile rezultate ca produsi de metabolism in urma administrarii hranei, inhiba germinarea zoosporilor, cel mai probabil datorita reducerii valorii pH-ului la nivelul rumenului [7].

7. ANALIZA LICHIDULUI RUMINAL

Analiza organoleptica a lichidului ruminal urmareste aprecierea: culorii, mirosului, consistentei, pH-ului, sedimentarea si flotatia.

Analizele biochimice ale lichidului ruminal se fac pentru a determina capacitatea de digestie a celulozei, de fermentarea a glucozei si de reducerea a nitratilor. Prin examen microscopic se apreciaza aspectul si cantitatile de microsimbionti ruminali.

8. Analiza organoleptica a lichidului ruminal

Analiza organoleptica a lichidului ruminal a constat in aprecierea culorii, mirosului, consistentei, pH-ului si sedimentarii.

Culoarea s-a apreciat prin examinarea vizuala a lichidului ruminal si a urmarit daca aceasta a fost specifica furajelor consumate de animal, de la galben-bruna in cazul consumului de paie sau siloz, la verde-brun in cazul consumului de furaje verzi.

Mirosul s-a apreciat prin examen olfactiv si a vizat modificarile de la mirosul normal, specific, aromat. Consistenta lichidului ruminal s-a apreciat vizual prin evaluarea gradului de vascozitate al acestuia. pH-ul s-a determinat cu ajutorul kiturilor si a urmarit variatiile de la valorile normale de 6,7-7,2. Aceste valori au tendinta de a scadea fiziologic in primele 3-5 ore de la ingestia de furaj. Timpul de sedimentare a particulelor s-a apreciat pe proba ca atare lasata in repaus intr-un pahar Berzelius timp de 5-10 minute de la recoltare; dupa acest interval particulele mai fine incep sa se ridice la suprafata.

9. Analiza chimica a lichidului ruminal

El-Yassin si col. [5], Dominguez si col. [4] au raportat pentru o proba de continut ruminal recoltat de la taurine si ulterior uscat, urmatoarea compozitie chimica bruta: 14,4% proteina bruta (PB), 4,2% grasime bruta (GB), 41,1% acid-detergent-fibra (ADF) si 9,7% cenusa bruta (CenB). Probele de lichid ruminal analizate in cadrul acestei cercetari nu au fost evaluate prin prisma analizelor biochimice.

10. Analiza microbiologica a lichidului ruminal

Microbiologic, la nivelul rumenului exista o populatie de 108 – 1010 microorganisme/g lichid ruminal, cele mai comune fiind bacteriile si protozoarele. Protozoarele din rumen contribuie la peste 50% din totalul biomasei microbiene ruminale [12], compozitia acestora fiind corelata cu tipul de alimentatie si specia de rumegatoare.

Protozoarele ciliate ruminale sunt sensibile la socul termic astfel incat, dupa recoltare, se impune transportarea probelor catre laboratorul de analiza in recipiente de sticla, la bain-marin, apa avand temperatura de aproximativ 40ºC. Se va acorda atentie modului de inchidere a recipientului intrucat exista riscul ca datorita producerii gazelor, la deschiderea acestuia, sa se produca mici „explozii’’ si astfel sa se piarda din continut; pe de alta parte, se va tine cont ca microsimbiontii ruminali sunt anaerobi ceea ce ii face sensibili la contactul cu oxigenul.

In vederea analizei, o prima etapa recomandata este cea de filtrare a lichidului rumial. Acest lucru se poate face prin trecerea lichidului prin 2-3 straturi de tifon intr-un alt vas, de preferinta umplut cu CO2 (avand densitatea mai mare decat cea a aerului, va ajuta la scoaterea acestuia si va facilita transferul de lichid ruminal).

Lichidul ruminal filtrat se poate analiza ca atare sau poate fi conservat in vederea unei analize ulterioare. Prin incubare la 39-41ºC si ingrijiri speciale, proba poate fi conservata pana la cinci zile astfel incat sa nu se piarda din calitatile initiale. Pentru conservare se pot folosi glutaraldehida 3%, formalina 5% sau amestecul verde de metil-formalina-clorura de sodiu urmat de incubarea la 40 ºC. Suplimentar, pentru a testa diferite modificari sau a mentine cat mai bine in viata microsimbiontii, se pot adauga diferite tipuri de alimente in culturi.

Se recomanda observarea la microscop la obiect 400x, imersia in ulei la 1000x afectand deplasarea microsimbiontilor ciliati. In vederea aprecierii incarcaturii cu protozoare a lichidului ruminal au fost efectuate recoltari de la animale abatorizate; lichidul ruminal a fost transportat la laborator in aproximativ doua ore de la recoltare si a fost analizat microbiologic. pH-ul probelor analizate a fost in jur de 6,5. In acest sens s-au efectuat analize lama-lamela, cu sau fara coloranti pentru o mai buna evidentiere a caracterelor morfologice ale protozoarelor.

11. Prepararea amestecului verde de metil-formalina-clorura de sodiu (MFS)

Dintre substantele recomandate pentru conservare si mai ales pentru evidentierea morfologica a nucleilor microsimbiontilor ciliati, acest amestec este cel mai eficient.

Amestecul este format din:

• 100 ml solutie de formaldehida 35%
• 900 ml apa distilata - 0,6 g verde de metil
• 8,0 g clorura de sodiu

12. Mod de preparare:

Se amesteca ingredientele mentionate anterior si se pastreaza la intuneric (verdele de metil este sensibil la lumina). Adaugarea solutiei de MFS peste proba de analizat (in cantitate de 5 pana la de 10 ori volumul acesteia) va colora numai nucleii microsimbiontilor ciliati. Pentru usurinta calcularii microsimbiontilor ciliati/cm3 se recomanda o dilutie de 10% utilizand 1 parte lichid ruminal si 9 parti solutie MFS. Analiza probei de lichid ruminal se poate face la microscop, obiectiv 400x, la aproximativ o jumatate de ora de la adaugarea solutiei de MFS. Prin pastrarea la intuneric, proba poate fi astfel analizata un timp indelungat.

13. Numararea microsimbiontilor ciliati/cm³

In vederea numararii microsimbiontilor ciliati, sunt recomandate mai multe procedee. Se recolteaza 40 ml lichid ruminal care se fixeaza intr-un volum egal de formalina 18,5% urmata de o prelucrare dupa Dehority [3]: se iau 1 ml proba lichid ruminal si coloreaza cu 2 picaturi verde briliant; se lasa 4 ore si apoi se face o dilutie in 9 ml glicerol 30%. Din proba astfel prelucrata se iau 1 ml lichid ruminal care se pune in camera de numarare. Dupa fixarea lichidului ruminal fixeaza intr-un volum egal de formalina 18,5% se iau 1 ml proba lichid ruminal si coloreaza cu 3 picaturi solutie Lugol; se lasa 15 minute si apoi se face o dilutie in 9 ml glicerol 30%, proba fiind astfel gata pentru numarare. Calcularea microsimbiontilor ruminali/cm3 (prelucrare dupa Alaska Science Consortium)

Exemplu: Proba de lichid ruminal se dilueaza 1:9 cu MFS. Se ia o picatura de lichid ruminal diluat avand diametrul de 0,5 mm (0,5 cm) si se plaseaza pe o lama peste care se pune o lamela avand dimensiunea de 22 x 22 mm (2,2 x 2,2 cm). Diametrul suprafetei examinate este de 460 μm (0,046 cm). In medie, s-au observat 6 microsimbionti ciliati in fiecare camp de vedere (obiectiv 400x).

14. Calcularea numarului de microsimbionti ciliati/cm³

Suprafata de vedere la microscop / Suprafata lamelei (2,2cm)2 ⁄ π r² = 2,2cm² ⁄ 3,14 x (0,046cm)2 = 4,8 ⁄ 0,00664 cm² = = 4,8 ⁄ 6,6 x 10 -3 cm² = 727,27 cm² = 7,3 x 102 Microsimbionti ciliati/picatura 6 microsimbionti ciliati x 7,3 x 102 = 4363,62 = 4,4 x 10 -3 microsimbionti ciliati/picatura Numarul de microsimbionti ciliati ⁄ picatura 4,4 x 10 -3 microsimbionti ciliati/picatura / volumul picaturii = = 4,4 x 10 -3 ⁄ 4/3 π r³ = = 4,4 x 10 -3 ⁄ 4/3 x 3,14 x 0,0025cm³ = 4,4 x 10 -3 ⁄ 6,5 x 10 -5 cm³ = 6,7 x 107 Numarul de microsimbionti ciliati ⁄ cm3 6,7 x 107 ⁄ 1 x 10 -1 = 6,7 x 108 microsimbionti ciliati ⁄ cm3* Analiza microbiologica a continutului ruminal a relevat variatii semnificative ale compozitiei acestuia in protozoare, in functie de o serie de factori: rasa, genul, varsta, starea fiziologica a animalului, structura ratiei si timpul de la ultima administrare a hranei. Conform observatiilor efectuate a fost propus un procedeu de prelucrare si valorificare a continutului ruminal in vederea obtinerii unui complex de substante bioactive cu valoare nutritiva imbunatatita fata de caracteristicile native, ce pot fi folosite ca atare in hrana animalelor sau prin prelucrari ulterioare, in diverse produse.