RECOLTAREA, EXAMENUL SI PRELUCRAREA SPERMEI LA TAURINE IN VEDEREA CONSERVARII

1. Recoltarea spermei

In cadrul programelor de IA, corecta colectare a spermei prezinta o importanta majora. Acest aspect implica programarea masculilor pentru recoltare la intervale optime, pregatirea acestora din punct de vedere sexual, precum si o tehnica corespunzatoare de recoltare a spermei.

Saltul si procedurile de stimulare. Manechinele vii - precum femele stimulatoare, alt mascul sau un mascul castrat - s-au dovedit a fi cele mai bune tehnici pentru recoltarea de rutina. Masculii pot fi antrenati sa exe­cute saltul atat pe parteneri, cat si pe manechine. Manechinele pot fi astfel construite, incat sa poata sustine vaginul artificial; manechinele sunt avantajoase datorita stabiiitatii crescute precum si prin controlul exercitat asupra transmiterii bolilor.

Pregatirea masculului inaintea recoltarii influenteaza numarul sper­matozoizilor obtinuti cu pana la 100%. Saltul executat pe alt mascul, neinstoat de ejaculare sau stimularea intensa timp de 5-10 minute genereaza rezultate bune. Stimulii considerati eficienti in intensificarea raspunsului sexual al taurului includ schimbarea partenerului stimulator, a locului in care sta acesta, introducerea unui taur nou in arealul in care are loc colectarea, precum si saltul neinsotit de ejaculare. Lichidele secretate in glandele sexuale accesorii pe parcursul perioadei preparatorii au rolul de a indeparta materialul contaminant din uretra.

2. Frecventa recoltarii spermei.

Cresterea frecventei recoltarii sper­mei determina scaderea numarului de spermatozoizi obtinuti, dar sporeste numarul spermatozoizilor obtinuti in unitate de timp.

La Tauri se prefera recoltarea spermei de doua ori pe zi, doua zile pe saptamana, rezultand astfel un volum mai mare care poate fi congelat in cadrul unei singure operatiuni. Este posibila si recoltarea zilnica, fara a afecta fertilitatea, insa descreste numarul spermatozoizilor dintr-un eja­culat, fiind necesari mai multi stimuli pentru obtinerea unui raspuns sexual adecvat.

3. Vaginul artificial.

Cea mai buna metoda de recoltare a spermei este reprezentata de utilizarea vaginului artificial, care are o alcatuire simpla si simuleaza (prin asigurarea unor conditii optime de temperatura, presiune si lubrefiere) copulatia naturala. Pastrarea stricta a conditiilor de igiena precum si o minima pregatire a operatorului asigura obtinerea unui eja­culat de buna calitate, necontaminat si reducerea la minim a riscurilor de accidentare. Pentru recoltarea fiecarui ejaculat se utilizeaza o camasa vaginala separata, sterila. Dimensiunile vaginului artificial si cele ale componentelor sale variaza in functie de specie.

Electroejacularea reprezinta metoda de ejaculare in cazurile in care masculul nu poate fi obisnuit cu vaginul artificial, sau daca afectiuni di­ferite impiedica efectuarea saltului. Metoda se foloseste cu succes la taur.

4. Metoda masajului.

Daca nu exista la indemana vreun aparat pentru electroejaculare, se poate apela la masarea pe cale transrectala a glande­lor veziculare si ampulelor canalelor deferente, generand astfel exterio­rizarea spermei. Este de dorit si masajul flexurii sigmoide pentru a se pro­duce protruzia penisului, astfel incat un alt operator poate colecta sperma cu o minima contaminare bacteriana. Sperma obtinuta consecutiv acestei proceduri are un continut scazut de spermazozoizi comparativ cu ejacu­latele obtinute in urma folosirii vaginului artificial. 

5. Examenul spermei

6. Evaluarea spermei si fertilitatea

Evaluarea spermei in relatie cu fertilitatea se face cel mai frecvent la taurine, si mai rar in cazul altor specii. Standardele minime utilizate pen­tru a clasifica un taur drept „probabil fertil" sunt: prezenta a peste 500 mili­oane spermatozoizi per ml, mai mult de 50% spermatozoizi cu miscari pro­gresive de inaintare, peste 80% spermatozoizi cu morfologie normala. Daca vreunul dintre aceste trei criterii nu este satisfacut la analiza a cel putin trei ejaculate diferite, taurul este suspectat a fi infertil, insa doar in cazul in care spermatozoizii motili sunt complet absenti si aparatul repro­ductiv al taurului a fost atent examinat, taurul poate fi declarat steril.

Evaluarea spermei trebuie sa se desfasoare rapid, astfel incat sa per­mita prelucrarea in vederea pastrarii calitatii initiale si fertilitatii. Nu exista un test unic care sa caracterizeze cu acuratete capacitatea fecun­danta a unui ejaculat, insa combinarea atenta a rezulatelor mai multor teste ofera criteriile necesare selectarii ejaculatelor cu capacitate fecun­danta crescuta. Ejaculatele sunt analizate din punct de vedere al mai mul­tor caracteristici, precum culoare, miros, vascozitate, pH, precum si al concentratiei, mobilitatii, anomaliilor etc., fiind utilizate criterii unitare de apreciere a rezultatelor obtinute (tabelul 1).

Tabelul 1. Nomenclatura parametrilor uzuali utilizati in evaluarea spermei

7. Aspectul si volumul spermei 

Sperma trebuie sa aiba un aspect opac, relativ uniform, indicator al concentratiei crescute a spermatozoizilor. Probele translucide contin putini spermatozoizi. Proba de sperma trebuie sa nu contina par, particole straine sau fragmente de tesuturi (indicatoare ale infectiilor aparatului reproducator). Unii tauri produc sperma galbuie in mod frecvent, fapt datorat prezentei riboflavinei, complet inofensive (nu trebuie confundata cu urina, care are miros specific).

In general, masculii tineri precum si cei apartinand speciilor de talie mica genereaza ejaculate mai reduse in volum. Ejacularea frecventa determinid volume scazute, iar in cazul recoltarii consecutive a doua ejaculate, cel de-al doilea va avea in mod cert un volum mai redus. Volumul redus nu are neaparat semnificatie patologica, insa este acompaniat de o con­centratie scazuta a spermatozoizilor. 

8. Concentratia spermatozoizilor

Determinarea cu acuratete a numarului de spermatozoizi per mili­litru de sperma este esentiala pentru stabilirea gradului si volumului de dilutie in vederea obtinerii unor doze de material seminal congelat de buna calitate..

Concentratia poate fi determinata prin metoda numararii in came­rele hemocitometrice de diferite tipuri, prin citirea gradului de refractie, cu ajutorul refractometrelor, sau cu ajutorul programelor de computer (software specializat), care afiseaza instantaneu caracteristicile spermei.

9.  Morfologia spermatozoizilor

In mod obisnuit, in sperma se evidentiaza prezenta unor spermato­zoizi anormali, fapt care nu este asociat cu o afectare a fertilitatii, atat timp cat proportia acestora nu depaseste aproximativ 20%; chiar si in aceast situatie, anumite tipuri de anomalii nu pot fi asociate cu infertili­tatea. Aprecierea morfologiei spermatozoizilor se face consecutiv uti­lizarii anumitor coloratii (Papanicolau, albastru de metilen, eozina­nigrozina - pentru evidentierea spermatozoizilor morti si a anomaliilor cromozomiale, sau coloratii supravitale - Kovacs-Foote, pentru evi­dentierea anomaliilor acrozomiale).

Anomaliile morfologice ale spermatozoizilor pot fi primare, secun­dare sau tertiare. Anomaliile primare sunt generate de disfunctii aparute in spermatogeneza, in timp ce anomaliile secundare se instaleaza pe par­cursul pasajului prin epididim. Afectarea spermatozoizilor pe parcursul ejacularii, consecutiv acesteia sau in timpul manevrelor de IA, genereaza anomaliile tertiare.

10. Anomalii mostenite ale spermatozoizilor

O larga varietate de defecte structurale ale spermatozoizilor pot cauza sterilitate sau fertilitate redusa la tauri si vieri, prin interferarea pro­cesului fecundatiei. Unele dintre aceste defecte sunt mostenite, nefiind inca elucidat modul de transmitere. Defectul localizat la extremitatea anterioara a capului postnuclear, rezulta din invaginarea membranei nucleare si reprezinta un simptom al tulburarii spermatogenezei.

Defectul numit „knob" (knobbed = cu noduri, lb. engleza~, eviden­tiat in principal la taurii din rasa Friza, imprumuta forma unui acrozom, afecteaza toti spermatozoizii ejaculatului, iar masculul afectat este steril. Este un caracter mostenit, datorat unei gene autozomale recesive. Un defect ,,knob" similar a fost semnalat in sperma vierilor apartinand rasei Marele Alb. Spermatozoizii afectati nu sunt capabili sa fecundeze ovocitele.

Defectul „decapitate" reprezinta o anomalie a cozii spermato­zoizilor evidentiata in sperma taurilor Guernesey sterili. Este asociat unei anomalii ultrastructurale in regiunea gatului sau a regiunii de implantare a spermatozoidului. Acesti spermatozoizi anormali se dezintegreaza in fragmente izolate reprezentand capete sau cozi de spermatozoizi, evi­dentiabile in regiunea capului epididimului.

In cazul defectului „dag", evidentiat la taurii Jersey Danez, piesa principala este puternic spiralata si pliata peste piesa intermediara, con­ferind aspectul unei cozi mai scurte. Aparitia acestui defect se datoreaza nivelurilor crescute ale zincului in spermatozoizi, precum si in lichidul seminal.

Alt defect detectat in sperma taurilor sterili din rasa Friza, acela al pseudo-picaturii, este caracterizat prin rasucirea sau ingrosarea piesei intermediare. Un defect rar intalnit, in special la taurii in varsta din rasa Rosie Daneza, este cel al piesei intermediare care are forma de tirbuson, evidentiat la 15-50% dintre spermatozoizi, care de altfel, sunt si morti. 

11. Mobilitatea spermatozoizilor

Inalta specializare a celulei spermatice este pe deplin justificata de scopul unic al existentei sale, si anume acela de a fecunda ovocita. Pe par­cursul deplasarii prin caile genitale ale masculului si mai apoi ale femelei, spermatozoizii strabat diferite medii in care trebuie sa supravietuiasca. Mobilitatea, o caracteristica importanta a spermatozoizilor sanatosi, este esentiala pentru fecundatie, insa nu reprezinta obligatoriu un indicator al capacitatii fecundante. Spermatozoizii normali isi pierd capacitatea fecundanta inainte de a-si pierde mobilitatea.

Cea mai simpla metoda de apreciere a mobilitatii spermatozoizilor este reprezentata de observatia vizuala, insa relevanta acesteia este scazuta. Este de asemenea posibila estimarea ratei mobilitatii spermato­zoizilor prin utilizarea testului mucusului cervical. La microscop, prin intermediul acestui test, sunt evidentiabile modificarile miscarilor de inaintare, pe masura strabaterii filamentelor de glicoproteine din mucusul cervical, precum si aglutinarea consecutiva.

Metodele fotoelectrice, electronice, precum si programele specializate disponibile pe computer, permit o apreciere precisa a mobilitatii spermato­zoizilor, a traiectoriei acestora precum si a tipurilor de miscari evidentiate. 

12. Aprecierea capacitatii fecundante a spermatozoizilor

Cel mai frecvent utilizat este testul penetrarii ovocitei de hamster (,,Zona-Free Hamster Ova Test"). Testul presupune prepararea si capaci­tarea spermei in vitro, superovularea femelelor de hamster, indepartarea zonei pellucida aferente ovocitei cu ajutorul tripsinei, incubarea spermei impreuna cu ovocitele denudate si in final, estimarea patrunderii sperma­tozoizilor in ovocite.

Alt test, utilizat indeosebi in tehnicile de reproducere asistata la om, este testul „inflamarii hipoosmotice" („Hypo-osmotic swelling test"), care consta in punerea in contact a spermei, fructozei si citratului de sodiu 150 mOsm in solutie apoasa. Consecutiv incubarii timp de 30-60 de minute la 37°C, la microscopul cu contrast de faza se evalueaza proportia spermatozoizilor care prezinta coada modificata, in sensul cresterii diametrului acesteia.

Bredbacka si col. (1997) propun utilizarea aprecierii morfologice a spermatozoizilor in combinatie cu fecundatia in vitro, drept modalitate de evaluare a fertilitatii taurilor. Pe scurt, sperma provenind de la un anumit mascul, este mai intai supusa examenului morfologic, iar mai apoi, uti­lizata pentru a fecunda in vitro ovocite provenite de la femele sacrificate la abator. Rezultatele acestui tip de test au fost ulterior confirmate prin uti­lizarea nemijlocita a materialului seminal congelat.

Tabelul 2. Caracteristici ale spermei (media±SD), varsta si fertilitatea cainilor clasificati ca „normali" sau „subnormali" functie de % spermatozoizilor cu morfologie normala (>60% respectiv <60%) (dupa Oettle, 1993)

Studiul lui Oettle (1993) a facut posibila corelarea caracteristicilor morfologice ale spermei cu fertilitatea, permitand astfel aprecierea indi­recta a capacitatii fecundante a acesteia. Ca urmare, sperma care contine mai mult de 60% spermatozoizi normali este considerata o sperma de cali­tate buna, iar cea care contine mai putin de 60% spermatozoizi normali, nu poate asigura o fecunditate corespunzatoare (13% in studiul citat).

Se Stie ca pentru fertilitateta masculului la specii diferite, precum Drosophila, soarece sau om cromozomul Y este esential (Vogt PH si col., 1998).

La om, trei regiuni genomice ale portiunii eucromatice a bratului lung Y(Yqll) au fost identificate ca gazduind cel putin cate o gena impor­tanta pentru fertilitate. Aceste regiuni Y au fost denumite regiuni ale Factorului Azoospermic („Azoospermia factor"): AZFa, AZFb si AZFc - deoarece barbatii cu deletia acestor segmente sufera de azoospermie.

Fiecare deletie a uneia dintre regiunile AZF pare a fi asociata cu o histopatologie diferita. Acest aspect sugereaza ca genele Y sunt functionale pe parcursul unor faze diferite ale spermatogenezei. Cateva gene Y cu o funclie potentiala in spermatogeneza sunt prezente in fiecare regiune AZF. Analizele lor moleculare au relevat existenta a doua tipuri: genele Y cu copii multiple pe cromozomul Y exprimate doar in tesutul tes­ticular (grupa I); gene Y cu o copie omoloaga a genei pe cromozomul X, exprimata in mai multe tesuturi. Despre unele dintre genele grupului I (RBM, DAZ) s-a demonstrat ca provin dintr-un omolog autozomal. Unele dintre genele apartinand ambelor grupe sunt incluse pe bratul scurt al cro­mozomului Y, aspect evidentiat la soarece.

In mod evident, cromozomul Y al mamiferelor reprezinta un sanc­tuar pentru genele care contribuie la rerteaua genetica care controleaza linia seminala precum si fertilitatea masculului.

13. Conservarea spermei 

14. Crioconservarea

Tehnica de conservare a spermei a fost revolutionata in urma cu aproximativ 50 de ani (Holt, 2000), cand s-a evidentiat faptul ca glicerolul are o actiune crioprotectoare. Aceasta observatie esentiala a permis con­gelarea spermatozoizilor, depozitarea lor pentru perioade indelungate si apoi utilizarea lor cu succes pentru insamantarile artificiale. Datorita fap­tului ca si cele mai performante tehnici de crioconservare induc criomo­dificari letale si subletale, nu este surprinzator ca eficienta transportului spermatozoizilor prin tractul genital femel poate fi drastic redusa con­secutiv crioconservarii.

15. Raspunsul celular la crioconservare si crioprotectori

Atunci cand celulele ingheata, sunt supuse stresului rezultat in urma interactiunii dintre apa si constituentii celulari, care apar pe parcursul for­marii cristalelor de gheata. Cristalizarea induce formarea unor incluziuni necongelate de solutii hiperosmotice, in timp ce procesul de racire catre temperatura de -50°C este in desfasurare. Studii electronomicroscopice efetuate pe spermatozoizi in diluant congelat au aratat ca unele celule sunt excluse din spatiul ocupat de catre cristalele de gheata, prin aceasta fiind expuse in mod deosebit la mediul anizoosmotic. Acest proces va conduce la extragerea apei intracelulare, deformarea consecutiva a celulei si posi­bilul influx de ioni. Decongelarea presupune fenomenele inverse, iar intrarea apei in celula poate genera rupturi ale membranei celulare. Deoarece inghetarea prea rapida poate duce la formarea intracelulara a cristalelor de gheata, ce au un efect letal, se considera ca rata optima de congelare este aceea care este suficient de lenta pentru a preveni formarea cristalelor de gheata, dar suficient de rapida pentru a minimiza efectele daunatoare ale expunerii prelungite la concentratiile crescute de saruri. Utilizarea solutiilor de saruri reprezinta metoda standard recomandata de literatura pentru metodele analitice de separare a proteinelor periferice de pe suprafata celulei. Expunerea spermatozoizilor la solutii hipertonice for­mate de catre cristalele de gheata in dezvoltare inseam na ca practic, acestia vor fi afectati prin inlaturarea proteinelor membranare pe parcursul acestei faze a crioconservarii, in cazul in care procesul se desfasoara prea lent.

Deoarece magnitudinea fluxului de apa este dependenta de rata de racire, valorile optime ale fluxului de apa ar trebui sa fie deductibile prin calcularea ratei optime de racire. Daca aceasta observatie si-a gasit con­firmarea in procesele de congelare a ovocitelor si embrionilor, lucrurile stau diferit in cazul spermei. Astfel, calcularea fluxului de apa depinde de modificarile parametrilor specifici membranei, conductivitatii hidraulice si energiei activate, insa datorita faptului ca spermatozoidul este o celula complexa, acesti parametri pot varia in diferitele domenii de membrana ale suprafetei spermatozoizilor. In plus, modificarile survenite in aglomerarile de lipide membranare pot induce variatii dependente de tempe­ratura ale parametrilor respectivi, iar crioprotectorii, indeosebi glicerolul, sunt recunoscuti pentru capacitatea lor de a interactiona cu lipidele mem­branare, afectand in acest mod parametrii corespunzatori.

16. Caracteristici de specie ale susceptibilitatii spermatozoizilor la crioalterari

A fost cu prisosinta demonstrat rolul exercitat de caracteristicile osmotice si chimice ale mediilor de conservare in supravietuirea sperma­tozoizilor. Alegerea solutiilor tampon, natura crioprotectantilor si a adi­tivilor precum zaharurile, chelatii de calciu, antioxidantii, a proteinelor din lapte si galbenusului de ou si-au dovedit influenla capitala in afectarea capacitatii de supravietuire a spermatozoizilor. Aceste substante indeplinesc in mod cert alte roluri decat acela de a modifica permeabili­tatea membranei celulare a spermatozoizilor fata de apa, ceea ce ar putea explica diferentele inregistrate intre rezultatele obtinute la variate specii.
In aceasta directie, merita luate in discutie variabilitatile de specie referitoare la efectele benefice sau nefaste ale glicerolului. In mod frecvent, spermatozoizii de taur sunt crioconservati utilizand glicerol in concentratii de 4-8%, find obtinute rezultate multumitoare atunci cand aceste concentratii au fost folosite si pentru conservarea spermei rumega­toarelor salbatice (cervidee si bovine, Holt -2000). Spermatozoizii de vier sufera deprecieri acrozomiale grave in cazul in care concentratia glicerolului depaseste 3%, iar la rozatoare, spermatozoizii sunt distrusi de glicerolul aflat in concentratii cu valori mai mari de 1,75%; in schimb, rezultatele optime in conservarea spermei de chinchilla au fost obtinute in cazul utilizarii glicerolului 6%. Aceste diferente pledeaza in favoarea implicarii glicerolului preponderent in afectarea structurii si functiilor membranei si mai putin in modificarea permeabilitatii acesteia. Este posi­bil ca glicerolul sa influenteze fluiditatea membranei, prin intercalarea sa intre cele doua straturi de lipide, precum si vascozitatea citoplasmatica intracelulara, afectand toate reactiile metabolice. A fost pusa in discutie chiar afectarea interactiunilor dintre proteinele citoscheletului si cele ale membranei spermatozoidului de soarece, de catre glicerol. In acest con­text, efectele potential disruptive au fost considerate drept benefice, deoarece a fost ameliorata toleranta la stresul osmotic asociata fluxurilor de apa.

In mod evident, crioconservarea implica expunerea la temperaturi foarte scazute, complet nefiziologice, chiar inaintea producerii inghetarii. Acest proces induce modificari bidimensionale in organizarea membra­nara (transformari de faza ale lipidelor) si consecutiv, transformari ale proprietatilor kinetice ale enzimelor intramembranare. Implicit, fusogeni­tatea membranei si raspunsurile la caile de traducere a semnalelor pot fi afectate de aceste modificari, marind probabilitatea ca longevitatea sper­matozoizilor post decongelare sa fie redusa datorita procesului accelerat de capacitare. In ideea corelarii susceptibilitatii membranei la crioalterare cu compozitia lipidica a membranei la diferite specii, s-a demonstrat ca socul termic, fenomen prin care crioalterarea este indusa prin racirea brusca, fara congelare, este mult mai drastic atunci cand concentratiile sterolice ale membranei spermatice sunt scazute, iar concentratiile acizilor grasi nesaturati sunt crescute.

Faptul ca toleranta la stresul osmotic aparut pe parcursul adaugarii sau inlaturarii substantei crioprotectoare poate ajuta la prevederea capa­citatii de supravietuire a spermatozoizilor consecutiv crioconservarii, poate fi apreciat in doua moduri. Mai intai, demonstreaza ca diferentele in structura membranara, permeabilitate si elasticitate determina limita pana la care spermatozoizii vor supravietui procesului de crioconservare. La nivel tehnic, aceasta informatie sugereaza ca supravietuirea spermato­zoizilor poate fi optimizata prin evitarea sau minimizarea efectelor socu­lui osmotic pe cat mai mult posibil. Mai apoi, trebuie subliniat faptul ca tehnica optima, care implica atat adaugarea cat si indepartarea graduala a glicerolului intr-o succesiune de aproximativ opt etape (crescatoare, respectiv descrescatoare), permite recuperarea a aproximativ 90% dintre spermatozoizii vii. Aceasta tehnica este deosebit de utila in cazul prelu­crarii spermei de slaba calitate, provenita de la indivizi supusi unor trata­mente care au printre efectele secundare, si afectarea caracteristicilor spermei.

Componentele care asigura un bun mediu de diluare a spermei tre­buie sa prezinte urmatoarele calitati: (a) sa asigure nutrienti, drept sursa de energie; (b) asigurarea protectiei impotriva actiunii daunatoare exerci­tate de racirea rapida; (c) sa reprezinte un tampon capabil sa previna mo­dificarile nocive ale pH-ului, rezultate in urma generarii acidului lactic; (d) mentinerea presiunii osmotice si a echilibrului electrolitic optime; (e) inhibarea dezvoltarii bacteriilor; (f) sporirea volumului spermei, in asa fel incat sa poata fi utilizata pentru mai multe inseminari; (g) sa protejeze celula spermatica pe parcursul procesului de congelare (Hafez, 1993).

Sperma de taur este in mod obisnuit diluata cu solutie de galbenus de ou citratat, lapte integral sau ecremat sau solutie de lactoza, fiind con­servata cu succes in diluanti organici precum Tris, TES, MES, sau HEPES. In vederea controlului proliferarii oricaror contaminanti micro­biologici, se impune adaugarea antibioticelor, considerandu-se ca amestecul penicilina / streptomicina confera un spectru suficient de larg pentru atin­gerea scopului propus. De asemenea, se recurge la adaugarea glicerolului, drept crioprotector. Si prezenta dimetilsulfoxidului (DMSO) sau a lactozei in diluant au o actiune benefica, servind ca agenti de deshidratare.

Insamantarile artificiale efectuate la scroafe cu sperma de vier congelatin au generat fertilitate scazuta precum si un numar redus de produsi. Fecunditatea scazuta a spermei congelate poate fi rezultatul unui interval scazut de supravietuire a spermatozoizilor (consecutiv decongelarii) in uter, jonctiunea utero-tubara si oviducte, comparativ cu situatia intalnita in cazul spermei proaspete.

Sperma bruta contine in medie 150 de milioane de spermatozoizi pe ml. In vederea congelarii, este necesara atingerea unei concentratii de 1 miliard de spermatozoizi in 0,5 ml (cat este volumul paietei), lucru posi­bil doar prin centrifugare. Consecutiv centrifugarii, se elimina o mare pro­portie a plasmei seminale (care este toxica pentru spermatozoizi), rezul­tand o concentratie crescuta a spermatozoizilor in sediment. Ulterior, aceasta poate fi rediluata la concentratia dorita. In prezent nu exista alta metoda care sa permita prelucrarea materialului seminal pentru congelare, cercetarile asidue permitand elaborarea unui protocol optim de centrifu­gare (din punct de vedere al diluantului - Glucoza EDTA, Glucoza Hepes, citrat EDTA; intensitatii - 400 la 1000 g, si timpului - 5 la 15 minute), care sa diminueze influenta negativa exercitata de centrifugare asupra spermatozoizilor.

Tentativele de identificare a unor metode variate de obtinere a unei concentratii mari de spermatozoizi mobili in volum cat mai redus, au con­dus la adaptarea unor metode de spalare-filtrare a materialului seminal utilizate in medicina umana, cum ar fi filtrarea prin coloana de Sephadex sau filtru Leucosorb L4.

Filtrul de Sephadex retine spermatozoizii cu defecte de acrozom, precum si pe cei cu mobilitate scazuta, fenomene explicabile prin capa­citatea Sephadexului de a cupla membrana celulei spermatice printr-o proteina cu structura asemanatoare cisteinei. Limitele acestei metode o fac utila pentru obtinerea unui ejaculat cu caracteristici superioare, sau pentru ameliorarea ejaculatelor necorespunzatoare, neputand fi utilizata ca substitut al centrifugarii.

O alta metoda utilizabila pentru ameliorarea caracteristicilor ejacu­latului (fara a inlocui insa centrifugarea) este cea bazata pe filtrul Leucosorb L4, filtru de membrana utilizat in medicina umana pentru adsorbtia leucocitelor. Valentele acestui filtru in reproducerea asistata au fost evidentiate in 1991 (pentru sperma de barbat) si 1996 (pentru cea de armasar), subliniindu-se ca in urma filtrarii rezulta un material seminal liber de detritusuri celulare si leucocite, precum si o populatie de sperma­tozoizi normali din punct de vedere morfologic si cu mobilitate crescuta.

Pentru ca materialul seminal sa poata fi utilizat si peste 24 de ore, este necesara racirea sa la temperatura de 5°C (valoare care determina scaderea activitatii metabolice la 1/10 din cea normala) si pastrarea la frigider. In cazul in care nu exista aparatura programabila pentru racire, aceleasi procente de gestatie se obtin si in cazul racirii materialului semi­nal de la 20 la 5°C prin simpla depunere in frigider, pe banca rotativa cu miscari continue de inclinare si rotatie (pentru a evita sedimentarea).

 Toate compo­nentele adaugate spermei brute, precum si gradul de racire pe unitate de timp trebuie sa asigure, dupa decongelare, pastrarea caracteristicilor esentiale ale spermatozoizilor legate de mobilitatea progresiva, enzimele acrozomiale, proteinele din membrana plasmatica precum si metabolis­mul energetic. Orice alterari, in indiferent ce grad, ale caracteristicilor esentiale ale spermatozoizilor enumerate mai sus, se repercuteaza asupra capacitatii fecundante a acestora, fara a afecta in mod obligatoriu si mobilitatea.