Transferul de embrioni la vaca (III). Aspecte privind ciclul sexual-partea a 2-a. Insamantarile artificiale - partea 1-a

Foliculul matur are aspectul unei vezicule ale carei dimensiuni variaza de la specie la specie: 4-6cm la iapa, 12-15mm la vaca, 7-8mm la oaie, capra si scroafa, 2-3mm la catea si pisica.

Ovulatia se desfasoara in mod normal atunci cand femelele beneficiaza de conditii de mediu corespunzatoare, adica de stimuli externi favorabili (lumina, caldura, umiditate), de o alimentatie cu nutreturi de o valoare biologica superioara etc.

La toate speciile de animale ovulatia este stimulata de actul montei. La mamiferele domestice ovulatia se produce spontan, de regula catre sfarsitul caldurilor (exceptie fac taurinele). Dupa ovulatie din structurile fostului folicul raman celulele granuloasei, teaca externa, teaca interna, resturi de lichid folicular si coaguli de sange. La vaca, scroafa si oaie hemoragia este neinsemnata. Sub influenta unui complex de factori se instaleaza o serie de modificari morfologice si biochimice ale vechilor structuri foliculare rezultand o noua formatiune endocrina numita corp galben sau corp luteal (CL) – glanda cu existenta efemera care secreta progesteron. Progesteronul secretat de corpul galben atenueaza modificarile realizate de estrogeni in stadiul de excitatie al ciclului sexual si pregateste endometrul pentru nidatie, impiedicand totodata contradictiile uterine. Hormonul inhiba secretia de FSH, fapt care previne maturarea unor noi foliculi ovarieni, precum si manifestarea caldurilor. Progesteronul are rolul principal in desfasurarea normala a gestatiei, asigurand schimburile nutritive si respiratorii intre mama si fat.

In evolutia corpului galben se disting trei faze:
1. luteogeneza (stadiul de organizare);
2. perioada luteotrofica (stadiul de eflorescenta);
3. perioada de luteoliza (stadiul de regresiune).

Perioada de luteogeneza incepe la bovine dupa 12 ore de la ovulatie si consta in organizarea corpului galben prin restructurari circulatorii; morfologice si biochimice pe baza elementelor celulare ale fostului folicul. In aceasta faza de organizare exista unele particularitati legate de specie. La vaca, durata perioadei de luteogeneza este de 5-6 zile. Perioada de eflorescenta (luteotrofica) se caracterizeaza printr-o serie de modificari determinate de factorii luteotrofici. La vaca si oaie activitatea corpului galben poate fi mentinuta doar de cuplul hormonilor LH si LTH. Stadiul de eflorescenta este perioada in care corpul galben secreta cantitatea cea mai mare de progestine. In parenchimul luteal are loc atat biosinteza progestinelor de catre celulele luteale provenite din granuloasa, cat si biosinteza, in continuare, a estrogenilor de catre celulele luteale tecale.

Cantitati mici de progestine sunt secretate de granuloasa chiar inainte de dehiscenta foliculara. Corpul galben este delimitat la exterior de o capsula conjunctiva, provenita din teaca externa care in acest stadiu este mult ingrosata si bogat vascularizata.

Perioada de luteoliza (regresiune) consta atat in regresia corpului galben datorita proceselor de degenerescenta grasa si de fagocitare a celulelor luteale cat si a proliferarii tesutului conjunctiv in detrimentul parenchimului. La vaca efectul luteolizei consta in scaderea nivelului progesteronului, incepand cu zilele 11-13 de activitate.

Factorul luteolitic este prostaglandina F2-alfa, secretata de endometru. Estrogenii de asemenea au un efect luteolitic. Valurile de prostaglandina incep din ziua a 11-13 si se inmultesc odata cu apropierea stadiului de excitatie.

Prostaglandina ajunge din vena uterina in artera ovariana; in ceea ce priveste mecanismul luteolizei, se pare ca prostaglandina anihileaza efectul trofic al LH-ului asupra tesutului luteinic. In consecinta, corpul galben se gaseste, pe de o parte, sub influenta efectului trofic al LH-ului si prolactinei, iar pe de alta parte, a factorului litic (prostaglandina). Incepand cu ziua a 13-14, la nivelul tesutului luteal apar granule lipoidice, scade activitatea enzimatica, se micsoreaza volumul celulelor, apare picnoza nucleilor (la vaca si oaie).
In stadiul de regresiune a corpului galben, biosinteza progestinelor treptat este micsorata, pana la sistarea completa.

Corpul galben poate fi:
- ciclic (progestativ) atunci cand nu s-a produs fecundatia; in consecinta corpul luteal are o perioada de existenta scurta si regreseaza catre sfarsitul fazei luteinice a ciclului sexual;
- corp galben de gestatie (gestativ), care se mentine pe ovar atat timp, cat dureaza gestatia;
- corp galben persistent (patologic): atunci cand diverse cauze, altele decat gestatia (dereglari hormonale, metrite), duc la prelungirea existentei lui.

Stadiul de inhibitie al ciclului sexual (luteinic)
Stadiul de inhibitie al ciclului sexual este faza de atenuare a estrului, reactia generala si calduri; urmeaza dupa stadiul de excitatie si se caracterizeaza prin reactie negativa a femelei fata de mascul – respingere sexuala. Animalul se linisteste, pofta de mancare, productivitatea de lapte si calitatea lui, precum si compozitia sangelui se restabilesc; secretia de mucus inceteaza, ovulatie trece in faza luteinica – perioada de organizare a corpului galben. Acest proces este coordonat de hormonul LH.
Organizarea corpului galben se soldeaza cu sinteza crescatoare a progesteronului care pregateste structurile morfologice uterine pentru nidatie, iar prin inhibarea sintezei de FSH sunt prevenite noi maturari foliculare sau ovulatii, femelele manifestand anafrodezie.
La vaci, epiteliul carunculilor uterini este puternic hiperemiat, uneori se produc rupturi vasculare, producandu-se metroragii.
In cazul in care nu s-a produs fecundatia, stadiul de inhibitie al ciclului sexual trece in stadiul de echilibru, iar dominanta sexuala se schimba cu cea alimentara.

Stadiul de echilibru al ciclului sexual
Stadiul de echilibru (de liniste) reprezinta perioada de stabilizare a produselor fiziologice din organismul femel. Comportamentul femelei este caracterizat printr-o stare de indiferenta fata de mascul.
In ovare are loc regresia corpului galben. Uterul proliferat in stadiile anterioare, involueaza. Se remarca trecerea treptata de la faza luteica la faza foliculara: scade nivelul progesteronului cauzat de regresia corpului galben si are loc cresterea nivelului hormonilor estrogeni secretati de catre foliculii ovarieni evolutivi, care antreneaza aparitia fenomenelor sexuale, deci marcheaza debutul unui nou ciclu sexual.

Factorii naturali care influenteaza ciclul sexual
Desfasurarea in conditii optime a procesului de reproductie la animale este conditionata de factorii mediului ambiant care actioneaza la toate etapele vietii acestora.
Desi ponderea cea mai mare o are furajarea, alti factori, ca cei de microclima, sezon, de ingrijire a animalelor, asigurarea unui proces tehnologic adecvat speciei si categoriei de exploatare, precum si factorul social (genitostimulatorii) pot avea o mare importanta in desfasurarea normala sau patologica a procesului de reproductie. La o alimentatie dezechilibrata sau insuficienta prima reactie este scaderea sau chiar oprirea functiei de reproductie, care poate fi preluata doar atunci cand nu au aparut leziuni ireversibile ale segmentelor aparatului genital si nutritia este imbunatatita. Alimentatia carentiala in cobalt, fosfor, fier, cupru si iod afecteaza secretia gonadotropinelor si astfel apare aciclia (anafrodezia).

La animale, functia de reproductie este influentata negativ sau pozitiv de factorii de microclima, ca temperatura, luminozitatea, umiditatea, curentii de aer, radiatiile calorice, compozitia aerului etc. Cand se incadreaza in anumite limite, acesti factori influenteaza favorabil activitatea organelor, circulatia, sistemul neuro-endocrin.

Este cunoscut efectul pozitiv al luminii asupra functiei hipotalamice, de care depinde sinteza si depletia hormonilor sexuali(exceptie fac ovinele, la care care scaderea duratei zilei este un stimulent). Reducerea ratei conceptiei la suine, taurine si ovine in lunile cu temperatura inalta se explica prin scaderea activitatii tiroidei, precum si diminuarea functiei endocrine si spermiogene a testiculului. La toate speciile de animale contactul dozat cu masculii genitostimulatori stimuleaza functia de reproductie la femele; prin prezenta berbecilor vasectomizati in turme inaintea sezonului de monta se poate grabi aparitia primului ciclu sexual la majoritatea oilor. Ovulatia la femele este grabita de asemenea si de stimulii exercitati de actul montei si alti excitanti neurosexuali omisi de catre masculi.

Ciclul sexual la vaca
Vaca se incadreaza in categoria femelelor policiclice, la care ciclul sexual se repeta ritmic in tot timpul anului, desi unele conditii de mediu intensifica manifestarile ciclurilor de calduri primavara si toamna. Dupa parturitie, ciclurile de calduri se manifesta din nou la 18-25 zile, in functie de ritmul involutiei uterine, starea de sanatate puerperala, nivelul productiei de lapte si factorii de alimentatie, intretinere si exploatare.

Dupa majoritatea autorilor, alaptarea influenteaza reluarea caldurilor. La vacile care alapteaza ele reapar mai tarziu decat la acelea care sunt separate de vitel; faptul se explica prin impulsurile inhibitoare care pornesc de la mamela in timpul suptului si care, actionand asupra sistemului nervos central, creeaza un factor dominant de excitatie – dominanta de lactatie, care inhiba centrul activitatii sexuale si, ca urmare, impulsul nervos necesar hipofizei pentru secretia hormonilor gonadotropi. Durata ciclului sexual la vaca este de 18-22 zile, cu o medie de 21 zile.

Stadiul de excitatie are o durata de 3-5 zile: 98 ore in medie vara si 84 ore in mediu iarna. In timpul estrului organele genitale sufera o serie de modificari: vulva este tumefiata si congestionata, labiile vulvare se ingroasa; vestibulul vaginal si vaginul se congestioneaza, iar glandele realizeaza o secretie locala abundenta de mucus. Coarnele uterine sunt in stare de erectie, aparent sunt reduse in lungime, are loc o puternica rulare si aducerea ovarelor in pozitie ventrala in raport cu uterul. Cervixul este congestionat, canalul cervical este deschis si permite uneori introducerea a 1-2 degete. Glandele endocervicale secreta un mucus abundent care se scurge prin comisura inferioara a vulvei. Secretia mucoasa este mai fluida si transparenta la inceputul estrului si devine mai vascoasa spre sfarsitul acestuia; uneori, mai ales la animalele tinere, mucusul estral are un aspect sanguinolent. Mucusul estral poseda calitati bacteriostatice si bactericide. Contactul femelelor cu taurii genitostimulatori mareste capacitatea bactericida a mucusului de 3 ori.

Frotiul executat din secretia vaginala prezinta un numar mare de celule epiteliale descuamate, cu resturi de nuclee; Ph-ul secretiilor vaginale oscileaza intre slab acid spre alcalin. Reactia generala se manifesta mai intens noaptea sau atunci cand mai multe femele se afla in stadiul de excitatie concomitent. Semnele clinice ale reactiei generale sunt: neliniste, apetit capricios si reducerea timpului pentru rumegare, deplasarea frecventa, scaderea productivitatii de lapte cu 25%, in medie. Laptele devine sarat sau amar (datorita estradiolemiei), mai gras si de culoare galbena si provoaca o usoara diaree la vitei. Intr-o colectivitate bovina (in padoc sau la pasune), femelele stabilesc contacte nazo-nazale sau nazo-genitale (perineale), accepta “imbratisarea” si efectueaza salturi pe alte femele, mimand prin miscarile copulatorii ale trenului posterior, actul coital.
In prezenta taurului, femela efectueaza saltul pe mascul, insa nu accepta imbratisarea acestuia; ea sta cu coada ridicata, incearca des sa urineze; insa mictiunea este slaba. Caldurile la vaci si vitele au o durata de 10-23 ore, in mediu 16 ore. In timpul caldurilor, la femele apare dorinta de impreunare.Vaca este in cautarea masculului: la vederea acestuia se indreapta spre el si ia pozitia caracteristica montei si accepta coitul. Dupa monta, femela ramane imobila, cifozata si cu coada ridicata. La unele vaci (cele grase, in stabulatie sau cele cu productie mare de lapte) simptomele caldurilor sunt mai putin pronuntate; la aceste animale caldurile se manifesta mai linistit. De aceea, pentru depistarea femelelor in calduri se recomanda folosirea taurilor genitostimulatori. Ovulatia la vaci se produce la 10-15 ore dupa sfarsitul caldurilor si se declanseaza in majoritatea cazurilor in timpul noptii sau dimineata. Contactul dozat al femelelor cu taurul genitostimulator intensifica manifestarea estrului, excitatiei sexuale si a caldurilor, iar coitul grabeste procesul ovulatiei si reduce durata caldurilor.

Formarea stadiului de excitatie la vaci.

De regula, la vaci, stadiul de excitatie debuteaza cu estrul, ulterior (la 2-4 zile) apare reactia generala si in cele din urma (la 4-15 ore) se manifesta caldurile. Uneori, la inceput se manifesta semnele reactiei generale, apoi estrul si caldurile; in alte cazuri aparitia si manifestarea celor trei fenomene sexuale are loc in acelasi timp. De aceea, se disting doua variante de formare a stadiului de excitatie al ciclului sexual de valoare completa: sincronica si asincronica. In cazul unei bune nutritii, intretineri si exploatari rationale, estrul, reactia generala si caldurile se manifesta aproape in acelasi interval de timp, sincronic. La formarea asincronica a stadiului de excitatie, inceputul manifestarii estrului, reactiei generale si a caldurilor nu coincide in timp. Aceasta determina, in cazul lipsei genitostimulatorilor, comiterea erorilor in depistarea caldurilor la femele si aparitia sterilitatii dobandite artificial. In stadiul de inhibitie al ciclului sexual dispare dorinta de impreunare si semnele excitatiei sexuale, treptat inceteaza secretia de mucus.Femelele manifesta o reactie negativa fata de mascul –respingere sexuala. La examenul rectal pe unul din ovare se poate palpa corpul galben in dezvoltare. In stadiul de echilibru vaca manifesta o stare de indiferenta fata de mascul. La examenul rectal, pe unul din ovare se palpeaza corpul galben ca o formatiune ovoida, proeminenta pe ovar, cu diametrul de 1-2cm, ce poate ocupa o buna parte din tesutul gonadei. Suprafata ovarului este deosebita datorita prezentei foliculilor in diferite stadii evolutive.

1. 2. Insamantarile artificiale

Considerate drept prima generatie de tehnici de reproducere asistata, insamantarile artificiale (IA) reprezinta cea mai importanta metoda pusa la punct in vederea realizarii rapide a progresului genetic la animale. Acest lucru este posibil deoarece existenta catorva masculi valorosi, selectionati conform unor criterii stricte, face posibila producerea unui numar suficient de spermatozoizi pentru a insemina mii de femele pe an, in timp ce un numar relativ mic de descendenti rezulta anual din mame valoroase, chiar si in conditiile utilizarii embriotransferului. Au fost perfectionate metodele de IA la bovine, ovine, caprine, suine, cabaline, canide, felide, pasari si chiar insecte (Hafez, 1993). Prima semnalare a utilizarii cu succes a acestei tehnici dateaza din 1789, cand abatele Spallanzani, renumit fiziolog italian, a obtinut primii pui de caine cu ajutorul acestei metode.

Principalele avantaje ale acestei tehnici ar putea fi urmatoarele:
1. realizarea progresului genetic;
2. controlul bolilor cu transmitere sexuala;
3. disponibilitatea evidentelor de reproductie riguroase, indispensabile unui bun management reproductiv;
4. randament si implicit, profit economic.
Valoarea deplina a IA transpare in conditiile utilizarii sale impreuna cu protocoalele de sincronizare a estrului (la rasele la care acest lucru este posibil), fiind si o potentiala metoda de control al sexului descendentilor, prin separarea spermatozoizilor care contin cromozomul X, de cei care contin cromozomul Y.
Aplicarea cu succes a acestei tehnici presupune utilizarea personalului calificat, precum si o buna depistare a estrului, in special in conditiile in care femelele sunt intretinute pe pasune.

Insamantarile artificiale in fermele de animale confera cateva avantaje in favoarea progresului genetic, controlului bolilor, precum si profit:
1. Permit larga raspandire a caracterelor valoroase apartinand taurilor de exceptie, diseminarea materialului genetic valoros chiar si in fermele mici.
2. Usureaza testarea descendentilor in conditii de mediu si intretinere diferite, prin aceasta contribuind la accelerarea si cresterea eficientei selectiei genetice.
3. Conduc la imbunatatirea performantelor si potentialului septelului, permitand elaborarea unor programe economice coerente.
4. Fac posibila schimbarea caracterelor dominante la nivelul metisilor, cum ar fi spre exemplu trecerea de la productia de lapte, la cea de carne.
5. Chiar si dupa moartea masculului donator, sperma congelata poate fi utilizata, prin aceasta contribuind la pastrarea liniilor selectionate.
6. Reduce riscul raspandirii bolilor cu transmitere pe cale sexuala.
7. Asigura un puternic instrument de cercetare, permitand investigarea unor aspecte ale fiziologiei reproductiei la femele si la masculi.
Progresul genetic obtinut consecutiv utilizarii IA la vacile de lapte a fost posibil datorita utilizarii unor tauri dovediti valorosi in urma incheierii testarii pe descendenti.

2. 2.1. Recoltarea, examenul si prelucrarea spermei in vederea conservarii

2.1.1. Managementul masculilor in vederea recoltarii spermei

Producerea unui material seminal de buna calitate depinde de conditiile asigurate masculilor. In cazul in care masculii tineri sunt hraniti si intretinuti corespunzator, sperma poate fi colectata eficient la urmatoarele varste aproximative: tauri - 12 luni; berbeci, tapi, vieri - 7 la 8 luni; armasari - 24 de luni.
Alimentatia exercita un efect notabil asupra gradului de dezvoltare sexuala la toate animalele de ferma. In cazul restrictionarii aportului energetic, cresterea testiculara este intarziata, momentul instalarii pubertatii este amanat iar productia spermatica este redusa. O alimentatie carentata prelungita poate cauza infertilitate. Pe de alta parte, o alimentatie care asigura unii nutrienti in exces determina ingrasarea masculilor si, de asemenea, afectarea caracteristicilor spermei.
Dimensiunile testiculare sunt importante prin corelatia evidentiata intre dimensiunile testiculelor si potentialul productiei spermatice. Testiculele se maresc in volum pe masura apropierii pubertatii, iar la varsta de aproximativ un an, taurii ating aproape 50% din potentialul caracteristic masculilor maturi. Dimensiunile testiculare reprezinta un caracter transmis dominant, monitorizarea sa facandu-se cu usurinta prin masurarea circumferintei scrotale.

2.1.2. Recoltarea spermei

In cadrul programelor de IA, corecta colectare a spermei prezinta o importanta majora. Acest aspect implica programarea masculilor pentru recoltare la intervale optime, pregatirea acestora din punct de vedere sexual, precum si o tehnica corespunzatoare de recoltare a spermei.

Saltul si procedurile de stimulare.
Manechinele vii - precum femele stimulatoare, alt mascul sau un mascul castrat - s-au dovedit a fi cele mai bune tehnici pentru recoltarea de rutina. Masculii pot fi antrenati sa execute saltul atat pe parteneri, cat si pe manechine. Manechinele pot fi astfel construite, incat sa poata sustine vaginul artificial; manechinele sunt avantajoase datorita stabilitatii crescute precum si prin controlul exercitat asupra transmiterii bolilor.
Pregatirea masculului inaintea recoltarii influenteaza numarul spermatozoizilor obtinuti cu pana la 100%. Saltul executat pe alt mascul, neinsotit de ejaculare sau stimularea intensa timp de 5-10 minute genereaza rezultate bune. Stimulii considerati eficienti in intensificarea raspunsului sexual al taurului includ schimbarea partenerului stimulator, a locului in care sta acesta, introducerea unui taur nou in arealul in care are loc colectarea, precum si saltul neinsotit de ejaculare. Lichidele secretate in glandele sexuale accesorii pe parcursul perioadei preparatorii au rolul de a indeparta materialul contaminant din uretra.

Frecventa recoltarii spermei.
Cresterea frecventei recoltarii spermei determina scaderea numarului de spermatozoizi obtinuti, dar sporeste numarul spermatozoizilor obtinuti in unitate de timp.
La tauri se prefera recoltarea spermei de doua ori pe zi, doua zile pe saptamana, rezultand astfel un volum mai mare care poate fi congelat in cadrul unei singure operatiuni. Este posibila si recoltarea zilnica, fara a afecta fertilitatea, insa descreste numarul spermatozoizilor dintr-un ejaculat, fiind necesari mai multi stimuli pentru obtinerea unui raspuns sexual adecvat.

Vaginul artificial.
Cea mai buna metoda de recoltare a spermei este reprezentata de utilizarea vaginului artificial, care are o alcatuire simpla si simuleaza (prin asigurarea unor conditii optime de temperatura, presiune si lubrefiere), copulatia naturala.
Pastrarea stricta a conditiilor de igiena precum si o minima pregatire a operatorului asigura obtinerea unui eja-culat de buna calitate, necontaminat si reducerea la minim a riscurilor de accidentare. Pentru recoltarea fiecarui ejaculat se utilizeaza o camasa vaginala separata, sterila. Dimensiunile vaginului artificial si cele ale componentelor sale variaza in functie de specie.

Electroejacularea
Electroejacularea reprezinta metoda de ejaculare in cazurile in care masculul nu poate fi obisnuit cu vaginul artificial, sau daca afectiuni diferite impiedica efectuarea saltului. Metoda se foloseste cu succes la taur.

Metoda masajului.
Daca nu exista la indemana vreun aparat pentru electroejaculare, se poate apela la masarea pe cale transrectala a glandelor veziculare si ampulelor canalelor deferente, generand astfel exteriorizarea spermei. Este de dorit si masajul flexurii sigmoide pentru a se produce protruzia penisului, astfel incat un alt operator poate colecta sperma cu o minima contaminare bacteriana. Sperma obtinuta consecutiv acestei proceduri are un continut scazut de spermazozoizi comparativ cu ejaculatele obtinute in urma folosirii vaginului artificial.

Continuarea in numerele viitoare...